一种油茶树miRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种油茶树miRNA及其应用,涉及植物学技术领域。该油茶树miRNA为miR156，所述miR156的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术中所述miR156的靶基因为CL15005.Contig2_All。所述miR156作用于靶基因CL15005.Contig2_All，靶基因CL15005.Contig2_All经表达产生催化13‑羟基十八碳二烯酸生成13‑氧代‑十八碳二烯酸的丁醇脱氢酶，并且miR156和其靶基因CL15005.Contig2_All的表达呈显著性负相关性，因此，miR156在调控丁醇脱氢酶表达中起到重要作用，miR156的表达能够调控油茶树中亚油酸的代谢，从而能够通过调控miR156的表达改善油茶的产量和品质。

【技术实现步骤摘要】
一种油茶树miRNA及其应用
本专利技术涉及植物学
，具体涉及一种油茶树miRNA及其应用。
技术介绍
油茶是起源于中国的一种重要的木本油料植物，可以从其籽仁中获得茶油。茶油是具有药用价值的食用油，含有高达90％的不饱和脂肪酸(包括油酸、亚油酸和棕榈酸)和少量的饱和脂肪酸，由于其脂肪酸组成与橄榄油类似，因此被称为“东方橄榄油”。油茶果实成熟过程是营养成分的合成和贮存过程，其中油脂是重要营养积累物质之一，其含量的高低和脂肪酸品质的好坏将直接关系到油茶经济价值的高低。在油茶果实成熟过程中，油酸相对含量逐渐上升，而亚油酸的相对含量则呈下降趋势。目前，从油茶树中已克隆得到油脂合成相关基因，如BCCP、ECH和FAD8等，但油茶的分子基础研究较弱，尤其是决定油茶产量和品质的分子机制，因此油茶中油脂合成的相关研究还处于探索阶段。MicroRNA(miRNA)是一类大小约22nt非编码的单链分子，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同导致靶mRNA的降解或翻译抑制，从而起到在转录和转录后水平上对基因表达进行负调控的作用。植物miRNA的作用方式主要为剪切靶基因，大多数植物miRNAs前体(pri-miRNA)来自其自身的转录单元，由RNApolymeraseII(PolII)转录而成，经过细胞核内的组装和酶催化作用后以miRNA:miRNA*形式转运至细胞质中，其中miRNA*被小RNA降解酶(SDN)降解，另一条功能成熟甲基化的miRNA与AGO蛋白(Argonaute)形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。RISC中的AGO1蛋白可直接切开与miRNA第10或11位互补的碱基，形成小片段并降解靶mRNA，进而导致靶基因的降解。有研究表明，miRNA在植物的生长、胚的发育、器官的发育与成熟及抗逆性中起着重要作用。目前，已经有223个物种、28645条前体的miRNA和35828条成熟miRNA收录在miRBase21.0(http://www.mirbase.org/)，研究对象主要集中在草本植物拟南芥和高粱、禾本科水稻和玉米等，而对木本植物的报道较少，尤其关于油茶树的miRNA。由于油茶的基因背景信息相对缺乏，到目前为止被发现和进行预测分析的油茶树miRNA仅是少量的，其中参与油脂合成的有miR5067、miR2118、miR482和miR1861。因此，有必要进一步挖掘和鉴定油茶树中功能性的miRNA，尤其是调控油脂合成和代谢的miRNA，从分子水平上探索油茶果实累积油脂的机制，改善油茶产量和品质。
技术实现思路
由鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种油茶树miRNA及其应用，该油茶树miRNA能够调控油茶树丁醇脱氢酶(butanoldehydrogenase)的表达，即该油茶树miRNA能够调控催化13-羟基十八碳二烯酸(13-hydroxy-octadecadienoicacid,13-HODE)生成13-氧代-十八碳二烯酸(13-oxo-octadecadienoicacid,13-oxoODE)的过程，在改善油茶产量和品质中具有潜在的应用价值。基于上述目的，本专利技术提供的一种油茶树miRNA及其应用，所述油茶树miRNA为miR156，所述miR156的碱基序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术通过HiSeq2500高通量测序平台和生物信息学分析等技术，首次从油茶湘林210号中鉴定了miR156，通过荧光定量PCR验证miR156及其靶基因表达的差异，得出亚油酸代谢与miR156呈显著负相关关系的结论，并通过靶基因功能分析发现本专利技术miR156对油茶果实成熟过程中亚油酸代谢途径内丁醇脱氢酶的表达具有重要调控作用，在改善油茶产量和品质中具有潜在应用价值。在本专利技术的一些实施例中，所述miR156的上游引物碱基序列如SEQIDNO.3所示，所述miR156的下游引物碱基序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一些实施例中，所述miR156的靶基因碱基序列如SEQIDNO.2所示，所述靶基因的上游引物碱基序列如SEQIDNO.6所示，所述靶基因的下游引物碱基序列如SEQIDNO.7所示。本专利技术中所述miR156的靶基因为CL15005.Contig2_All。所述miR156作用于靶基因CL15005.Contig2_All，靶基因CL15005.Contig2_All经表达能产生催化13-羟基十八碳二烯酸生成13-氧代-十八碳二烯酸的丁醇脱氢酶，且miR156和靶基因CL15005.Contig2_All的表达呈显著性负相关性。因此，miR156对油茶果实成熟过程中亚油酸代谢途径内丁醇脱氢酶的表达具有重要调控作用，从而能够通过调控miR156的表达改善油茶的产量和品质。基于相同的专利技术构思，本专利技术还提供了油茶树miRNA在调控亚油酸代谢中的应用。在本专利技术的一些实施例中，所述miR156调控丁醇脱氢酶的表达。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术miR156通过作用于靶基因CL15005.Contig2_All而能够调控油茶果实中丁醇脱氢酶的表达，进而miR156在调控13-羟基十八碳二烯酸生成13-氧代-十八碳二烯酸的过程中起到重要作用，油茶树miR156的表达可调控油茶果实成熟过程中亚油酸的代谢，在改善油茶的产量和品质中具有潜在应用价值。附图说明图1为亚油酸代谢的KEGGPathway图；图2为miR156及靶基因CL15005.Contig2_All在油茶树果实和花中的相对表达量。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术进一步详细说明。实施例1miRNA的筛选和鉴定1.1植物材料和样品的准备以湖南省永州市冷水滩区湖南科技学院油茶基地湘林210号油茶品种为试验材料，采用S型采样法分别采摘10月份和7月份的果实，液氮速冻后，-80℃下冷冻备用。1.2油茶树miRNA的高通量测序采用Trizol法提取油茶树RNA(1)分别取油茶树花和果实各0.1g置于研磨中，立即加入液氮研磨至细粉状；(2)将上述花和果实粉末分别移至用DEPC处理的1.5mL离心管中，随后分别加入1000μLTrizol试剂，充分混匀后于冰上静置5min；(3)向步骤(2)处理后的离心管中分别加入200μL的氯仿后盖紧离心管，用力摇动15s，使离心管中的物质充分混匀，静置5min后于4℃下12000r/min离心15min；(4)离心完成后，分别吸取离心管上层水相500μL，然后分别转入新的离心管中，再加入等体积的异丙醇，充分混匀后于室温静置10min，4℃下12000r/min离心10min；(5)分别去掉步骤(4)处理后的离心管中的上清液，然后分别向离心管中加入1mL现配的75％乙醇振荡洗涤沉淀一次，4℃下7500r/min离心5min；(6)分别去掉步骤(5)处理后的离心管中的上清液，然后将留有沉淀的离心管置于超净台内风吹10min后再分别加入30μL经DEPC处理的双蒸水进行溶解；(7)通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染；通过Nanodrop检测RNA的纯度，即OD260/OD280的比值；通过Qubit荧光计对RNA浓度进行精确本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种油茶树miRNA，其特征在于，所述油茶树miRNA为miR156，所述miR156的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种油茶树miRNA，其特征在于，所述油茶树miRNA为miR156，所述miR156的碱基序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的油茶树miRNA，其特征在于，所述miR156的上游引物碱基序列如SEQIDNO.3所示，所述miR156的下游引物碱基序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求1所述的油茶树miRNA，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：覃佐东，刘晓霞，罗小芳，李治章，何福林，管天球，
申请(专利权)人：湖南科技学院，
类型：发明
国别省市：湖南,43