基于KASP技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法技术

本发明专利技术提供基于KASP技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法。五种叶绿体胞质类型鉴定特异引物，分别为B型，12对SNP引物；C型，10对引物包括1对InDel和9对SNP引物；D型，3对引物包括1对InDel和2对SNP引物；HS型，19对引物包括2对InDel和17对SNP引物；T型，7对SNP引物。该方法可用于鉴定玉米自交系或杂交种的胞质类型，鉴定玉米自交系或杂交种母本的胞质类型，对玉米材料进行分类划群反映母系演化进程。该方法的应用在基因组水平上拓展了玉米材料类群划分、母系追踪的分析方法，为玉米细胞质遗传特性研究提供了新思路和手段。

【技术实现步骤摘要】
基于KASP技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法
本专利技术属于农作物分子生物学
，具体地说，涉及基于KASP技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法。
技术介绍
玉米是全球第一大作物，在我国农业生产中具有重要地位；是杂交良种应用最早最普及的作物，也是全球和我国种业市场份额最大的作物。父母本双亲的筛选是培育优良玉米杂交种的关键因素，因此针对于双亲自交系类群划分的研究报道颇多，但均是基于核基因组分子标记的分析。即主要是从核基因组染色体重组方面进行分析，该遗传变异主要是由于人工组配选育优良材料导致的。叶绿体是绿色植物进行光合作用的细胞器，拥有自身完整的一套基因组，称为叶绿体基因组。叶绿体基因组结构非常保守，DNA一般为双链环状分子，高等植物中叶绿体基因组大小一般为120-160kb。与核基因组不同，叶绿体基因组具有细胞质遗传的特点，植物叶绿体基因组为单亲遗传(多数为母系遗传)，一般不发生重组；叶绿体具有基因组较小且相对保守，分子进化速率慢，基因组的遗传变异容易受到群体遗传效应的影响；因此叶绿体分子标记是研究群体分化的有效手段。禾本科植物玉米叶绿体基因组属于严格母系遗传，基于叶绿体基因组的分子标记对玉米材料进行分析，可以鉴定出玉米分化形成的几种叶绿体胞质类型。高通量测序和基因组生物信息学分析技术的成熟，有效促进了对叶绿体基因组的研究。从叶绿体基因组水平上挖掘单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失多态(InDel)等分子标记位点成为可能。KASP(KompetitiveAlleleSpecificPCR)为竞争性等位基因特异性PCR技术，具备试验流程简单、高效、灵活、易操作等特点，适合SNP/InDel等二态性标记类型的基因分型检测。现有玉米自交系、种质资源材料的分类和划群均是基于细胞核基因组信息，植物细胞中除细胞核遗传外，还具有细胞质遗传，即叶绿体和线粒体基因组信息。细胞质基因组信息尤其是叶绿体基因组具有上述优点，更加适合于对玉米材料从早期分化上进行分类划群，反映母本单系演化进程。因此，本专利技术利用重测序数据开发玉米叶绿体胞质类型的特异位点，基于KASP基因分型平台设计引物并进行验证评估，建立玉米叶绿体胞质类型鉴定的一种方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供基于KASP技术的玉米叶绿体胞质类型的鉴定方法。本专利技术的专利技术构思如下：(1)170份玉米代表性材料的选取，包括我国所有杂种优势群，甜糯、地方品种、以及细胞质CMS不育类型等样品。(2)高浓度、高质量总DNA制备。(3)基于二代测序平台的高通量测序，构建文库大小为500bp、PE140、测序深度为5倍。(4)全基因组序列数据处理、叶绿体基因组拼接，使用两个软件独立拼接，基于玉米B73叶绿体基因组序列利用BLAST程序筛选属于叶绿体基因组的contig，进行组装，验证序列准确性。(5)叶绿体基因组注释、多态位点确定，利用DOGMA软件注释叶绿体基因组，将170份材料叶绿体基因组序列进行比对，筛选出100个SNP/InDel叶绿体基因组变异位点。(6)玉米五种叶绿体胞质类型的确定，基于170份材料叶绿体基因组序列利用MP(MaximumParsimony)最大简约法和ML(MaximumLikelihood)最大似然法分别建立系统进化聚类图，结果显示所有样品被划分为五种类型。五种类型分别为：B型为改良瑞德、改良兰卡以及美国骨干自交系材料；C型为C型细胞质不育材料；D型为旅大红骨杂优群、地方品种以及热带材料；HS型为S型细胞质不育材料和唐四平头杂优群材料；T型为T型细胞质不育材料。(7)五种胞质类型特异鉴定位点的确定，分析五种类群之间的Fst值(遗传分化系数)，Fst值大于0.9为该类群的特异位点。玉米B、C、D、HS、T五种胞质类型分别分析获得B型特异位点12个，C型特异位点11个，D型特异位点4个，HS型特异位点20个，T型特异位点7个。(8)引物设计、评估与验证，基于KASP技术体系设计上述特异位点的引物，利用94份代表五种类型的样品在以下四个方面进行引物评估，第一扩增是否成功，第二是否反映了母系遗传，第三与测序结果是否一致，第四是否为五种叶绿体胞质类型的特异引物。最终获得玉米B、C、D、HS、T五种叶绿体胞质类型鉴定特异引物分别是12、10、3、19、7对。位点具体信息见表1-表5，引物具体信息见表6。本专利技术中基于KASP技术体系的玉米五种叶绿体胞质类型鉴定特异引物获得的技术路线图见图1。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米B型胞质材料的分子标记，所述分子标记选自以下12个SNP标记中的至少一个，它们的位点信息如表1所示：表1本专利技术提供的基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米C型胞质不育材料的分子标记，所述分子标记选自以下9个SNP标记和1个InDel标记中的至少一个，它们的信息如表2所示：表2本专利技术提供的基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米D型胞质材料的分子标记，所述分子标记选自以下2个SNP标记和1个InDel标记中的至少一个，它们的位点信息如表3所示：表3本专利技术提供的基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米HS型胞质不育材料的分子标记，所述分子标记选自以下17个SNP标记和2个InDel标记中的至少一个，它们的位点信息如表4所示：表4其中，所述InDel标记CPMIDP01和CPMIDP02的核苷酸序列分别如SEQIDNO:103-104所示。本专利技术提供的基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米T型胞质不育材料的分子标记，所述分子标记选自以下7个SNP标记中的至少一个，它们的位点信息如表5所示：表5所述分子标记的物理位置是基于玉米品种B73叶绿体基因组序列而确定的，所述玉米品种B73叶绿体基因组的版本号为AGPv3。本专利技术还提供基于KASP技术开发的用于检测表1-表5所述分子标记的引物。优选地，用于检测表1中标记CPMSNP01～CPMSNP93的KASP引物序列分别如SEQIDNO:105-140所示，其中用于检测标记CPMSNP01的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQIDNO:105-107，用于检测标记CPMSNP02的KASP引物为SEQIDNO:108-110，以此类推。优选地，用于检测表2中标记CPMIDP10～CPMSNP81的KASP引物序列分别如SEQIDNO:141-170所示，其中用于检测标记CPMIDP10的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQIDNO:141-143，用于检测标记CPMSNP18的KASP引物为SEQIDNO:144-146，以此类推。优选地，用于检测表3中标记CPMIDP07～CPMSNP19的KASP引物序列分别如SEQIDNO:171-179所示，其中用于检测标记CPMIDP07的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQIDNO:171-173，用于检测标记CPMSNP07的KASP引物为SEQIDNO:174-176，以此类推。优选地，用于检测表4中标记CPMIDP01～CPMSNP96的KASP引物序列分别如SEQIDNO:180-237所示，其中用于检测标记CPMIDP01的KASP引物包括上游引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米B型胞质材料的分子标记，其特征在于，所述分子标记选自以下12个SNP标记中的至少一个，它们的信息如表1所示：表1

【技术特征摘要】
1.基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米B型胞质材料的分子标记，其特征在于，所述分子标记选自以下12个SNP标记中的至少一个，它们的信息如表1所示：表12.基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米C型胞质不育材料的分子标记，其特征在于，所述分子标记选自以下9个SNP标记和1个InDel标记中的至少一个，它们的信息如表2所示：表2。3.基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米D型胞质材料的分子标记，其特征在于，所述分子标记选自以下2个SNP标记和1个InDel标记中的至少一个，它们的信息如表3所示：表3。4.基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米HS型胞质不育材料的分子标记，其特征在于，所述分子标记选自以下17个SNP标记和2个InDel标记中的至少一个，它们的信息如表4所示：表45.基于叶绿体基因组开发的用于鉴定玉米T型胞质不育材料的分子标记，其特征在于，所述。分子标记选自以下7个SNP标记中的至少一个，它们的信息如表5所示：表5。6.基于KASP技术开发的用于检测权利要求1-5任一项所述分子标记的引物，其特征在于，用于检测表1中标记CPMSNP01～CPMSNP93的KASP引物序列分别如SEQIDNO:105-140所示，其中用于检测标记CPMSNP01的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQIDNO:105-107，用于检测标记CPMSNP02的KASP引物为SEQIDNO:108-110，以此类推；用于检测表2中标记CPMIDP10～CPMSNP81的KASP引物序列分别如SEQIDNO:141-170所示，其中用于检测标记CPMIDP10的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQIDNO:141-143，用于检测标记CPMSNP18的KASP引物为SEQIDNO:144-146，以此类推；用于检测表3中标记CPMIDP07～CPMSNP19的KASP引物序列分别如SEQIDNO:171-179所示，其中用于检测标记CPMIDP07的KASP引物包括上游引物1、上游引物2和下游通用引物，序列为SEQIDNO:171-173，用于检测标记CPMSNP07的KASP引物为SEQIDNO:174-176，以此类推；用于检测表4中标记CPMIDP01～CPMSNP96...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凤格，王蕊，田红丽，赵久然，杨扬，许理文，易红梅，葛建镕，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11