一种利用生物酶转化制备鼠李素的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用生物酶转化制备鼠李素的方法，是在光合细菌培养基中接入光合细菌菌种培养得到光合细菌培养液，离心后收集上清液得粗酶液；北桑寄生药材用乙醇水溶液提取，提取液减压浓缩得醇浸膏；醇浸膏用水捏溶后上大孔吸附树脂柱，分别用水和乙醇溶液洗脱，将洗脱液进行减压浓缩可得富集总黄酮浸膏；将粗酶液与溶有醇浸膏或富集总黄酮浸膏的光合细菌培养基混合培养，进行生物转化，得酶转化液；酶转化液离心，弃去上清液，沉淀部分减压干燥得转化物；对转化物进行分离，得鼠李素单体。本发明专利技术方法操作简单，提取物质得率高，纯度高。

【技术实现步骤摘要】
一种利用生物酶转化制备鼠李素的方法
本专利技术属于生物转化
，特别是一种利用生物酶转化制备鼠李素的方法。
技术介绍
北桑寄生(LoranthustanakaeFranch.etSav.)系桑寄生科桑寄生属植物。研究证明北桑寄生含有黄酮类、糖类、挥发油、酚类等活性成分。北桑寄生的带叶茎枝，有强筋骨、祛风湿、降血压等作用。光合细菌(PSB)是一类能够进行不放氧光合作用的水生微生物的总称，广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处。从最近光合细菌分离的研究文献来看，分离源主要为养殖废水、工业富营养化的有机废水以及生活污水等。光合细菌利用水体中有机物、硫化氢、氨等作为供氢体进行光合作用，起到净化水质的作用，对环境保护有着十分重要的意义。近年来，光合细菌多被用于大范围水体富营养化污染的净化、改善水产养殖环境、动物疾病的防治，诱导植物的抗病毒活性、生物制氢等方面；因具有抗氧化、抗肿瘤及免疫活性的作用，也被用于制药领域等。鼠李素，分子式为C16H12O7，CAS号为90-19-7，化学名为3,5,3',4'-四羟基-7-甲氧基黄酮。鼠李素是一种黄酮类物质，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种作用，具有广阔的应用前景。文献报道，可以从桉树的茎皮、Guierasenegalensis叶和Rhamnuspetiolaris的浆果中分离鼠李素，其中成分复杂、鼠李素含量低、操作比较复杂，尤其是高纯度的鼠李素制备方法，采用多种柱色谱分离，很难实现工业化生产。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种分离方法简单、分离效率高的利用生物酶转化制备鼠李素的方法。为解决以上技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种利用生物酶转化制备鼠李素的方法，包括步骤：（1）在经过灭菌后的光合细菌培养基中接入光合细菌菌种，在光照、厌氧条件下培养得到光合细菌培养液；所述光合细菌培养液经离心后，收集上清液，得粗酶液；（2）称取粉碎后的北桑寄生药材，用乙醇水溶液回流或超声提取，合并提取液，提取液减压浓缩得醇浸膏；（3）将步骤（2）得到的醇浸膏用水捏溶，上大孔吸附树脂柱，先用水洗，再用乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液进行减压浓缩可得富集总黄酮浸膏；（4）将步骤（1）所得粗酶液，与溶有步骤（2）所得醇浸膏或与步骤（3）所得富集总黄酮浸膏的光合细菌培养基混合培养，进行生物转化，条件为：温度15-60℃、pH值5-10、转化时间为24-120h，得酶转化液；（5）将步骤（4）制得的酶转化液经2000-10000r/min离心，弃去上清液，沉淀部分减压干燥得转化物；（6）利用常规柱色谱，对转化物进行分离，得鼠李素单体。进一步地，步骤（1）中所述的光合细菌菌种为红螺菌属Rhodospirillum、红假单胞菌属Rhodopseudomonas、红细菌属Rhodobacter中的任意一株菌或它们的任意组合。进一步地，步骤（1）中，在经过灭菌后的光合细菌培养基中接入1/20-1/5的光合细菌菌种，在光照、厌氧条件下培养2-5天作为光合细菌培养液；将所述光合细菌培养液2000-10000r/min离心，收集上清液，得粗酶液。进一步地，步骤（3）中所用到的大孔吸附树脂为HPD-100或AB-8或D101大孔吸附树脂。进一步地，步骤（3）中所用到的乙醇溶液浓度为30%-75%。进一步地，步骤（6）中所用到的柱色谱是硅胶柱色谱或聚酰胺柱色谱。本专利技术构思是将北桑寄生中的总黄酮作为底物，与光合细菌粗酶液混合，将转化液经处理后制备鼠李素。利用光合细菌粗酶液可完全水解总黄酮中的4个黄酮鼠李糖苷，其中鼠李素鼠李糖苷的糖基部分完全水解，可得到其苷元鼠李素。该方法操作简单安全，经济实用，提取物质得率高，纯度高。附图说明图1为光合细菌粗酶转化0h对照HPLC图谱。图2为光合细菌粗酶转化0hHPLC图谱。图3为光合细菌粗酶转化24hHPLC图谱。图4为光合细菌粗酶转化72hHPLC图谱。具体实施方式本专利技术一种典型的实施方式提供的一种利用生物酶转化制备鼠李素的方法，包括步骤：（1）在经过灭菌后的光合细菌培养基中接入光合细菌菌种，在光照、厌氧条件下培养得到光合细菌培养液；所述光合细菌培养液经离心后，收集上清液，得粗酶液；（2）称取粉碎后的北桑寄生药材，用乙醇水溶液回流或超声提取，优选地，用5-30倍量的乙醇水溶液回流或超声提取2-3次，每次0.5-2h，合并提取液，提取液减压浓缩得醇浸膏；该醇浸膏中总黄酮含量为30%-60%。（3）将步骤（2）得到的醇浸膏用水捏溶，上大孔吸附树脂柱，先用水洗，再用乙醇溶液进行洗脱，优选地，先用3-5倍量水洗，再用5-20倍量乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液进行减压浓缩可得富集总黄酮浸膏。该富集总黄酮浸膏中总黄酮含量为65%-90%，鼠李素-3-O-鼠李糖苷含量占总黄酮的70%-80%。（4）将步骤（1）所得粗酶液，与溶有步骤（2）所得醇浸膏或与步骤（3）所得富集总黄酮浸膏的光合细菌培养基混合培养，进行生物转化，条件为：温度15-60℃、pH值5-10、转化时间为24-120h，得酶转化液。优选地，粗酶液与溶有醇浸膏的光合细菌培养基混合后，醇浸膏浓度为0.1-10g/L；粗酶液与溶有富集总黄酮浸膏的光合细菌培养基混合后，富集总黄酮浸膏浓度为0.1-10g/L。（5）将步骤（4）制得的酶转化液经2000-10000r/min离心，弃去上清液，沉淀部分减压干燥得转化物；该转化物中鼠李素占转化物总质量的60%-80%。（6）利用常规柱色谱，对转化物进行分离，得鼠李素单体，其纯度可达到98%以上。北桑寄生寄生于栎属、榆属、李属、桦属等植物上，对寄主树木有一定害处，其综合利用有一定的环境效益。本专利技术利用自然界中存在的北桑寄生，其总黄酮含量很高，经简单富集（步骤3）后提取物中总黄酮含量为65%-90%，尤其黄酮苷类物质鼠李素-3-O-鼠李糖苷的含量最高，可占到北桑寄生总黄酮含量的70%-80%。本专利技术可直接用北桑寄生总黄酮作为底物，通过生物酶转化的方式制备鼠李素，其操作简单安全，经济实用，提取物质得率高，纯度高。利用光合细菌粗酶液可完全水解总黄酮中的4个黄酮鼠李糖苷，其中鼠李素鼠李糖苷的糖基部分完全水解，可得到其苷元鼠李素。该方法具有温和、经济、环保等优点。鼠李素具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种生物活性，同时还可通过抑制氧化应激和炎性介质来减弱黑色素的生成；通过抑制海马炎症反应及小鼠创伤性脑损伤的氧化应激来减弱认知障碍等，在医学临床治疗领域具有广阔的应用前景，但其在市面上的销售价格昂贵。采用本专利技术方法可利用少量的资源通过环保安全的手段制备高纯度鼠李素。适合用于工业生产，避免工业污染，可满足食品及临床需要。在优选的实施方式中，步骤（1）中所述的光合细菌菌种为红螺菌属Rhodospirillum、红假单胞菌属Rhodopseudomonas、红细菌属Rhodobacter中的任意一株菌或它们的任意组合。所述红螺菌属Rhodospirillum，如深红红螺菌（Rhodospirillumrubrum)；红假单胞菌属Rhodopseudomonas，如沼泽红假单胞菌（Rhodopseudanonaspalustris）、绿色红假单胞菌（Rhndopxeudomona本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用生物酶转化制备鼠李素的方法，其特征在于，包括步骤：在经过灭菌后的光合细菌培养基中接入光合细菌菌种，在光照、厌氧条件下培养得到光合细菌培养液；所述光合细菌培养液经离心后，收集上清液，得粗酶液；称取粉碎后的北桑寄生药材，用乙醇水溶液回流或超声提取，合并提取液，提取液减压浓缩得醇浸膏；将步骤（2）得到的醇浸膏用水捏溶，上大孔吸附树脂柱，先用水洗，再用乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液进行减压浓缩可得富集总黄酮浸膏；将步骤（1）所得粗酶液，与溶有步骤（2）所得醇浸膏或与步骤（3）所得富集总黄酮浸膏的光合细菌培养基混合培养，进行生物转化，条件为：温度15‑60℃、pH值5‑10、转化时间为24‑120 h，得酶转化液；将步骤（4）制得的酶转化液经2000‑10000 r/min离心，弃去上清液，沉淀部分减压干燥得转化物；利用常规柱色谱，对转化物进行分离，得鼠李素单体。

【技术特征摘要】
1.一种利用生物酶转化制备鼠李素的方法，其特征在于，包括步骤：在经过灭菌后的光合细菌培养基中接入光合细菌菌种，在光照、厌氧条件下培养得到光合细菌培养液；所述光合细菌培养液经离心后，收集上清液，得粗酶液；称取粉碎后的北桑寄生药材，用乙醇水溶液回流或超声提取，合并提取液，提取液减压浓缩得醇浸膏；将步骤（2）得到的醇浸膏用水捏溶，上大孔吸附树脂柱，先用水洗，再用乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液进行减压浓缩可得富集总黄酮浸膏；将步骤（1）所得粗酶液，与溶有步骤（2）所得醇浸膏或与步骤（3）所得富集总黄酮浸膏的光合细菌培养基混合培养，进行生物转化，条件为：温度15-60℃、pH值5-10、转化时间为24-120h，得酶转化液；将步骤（4）制得的酶转化液经2000-10000r/min离心，弃去上清液，沉淀部分减压干燥得转化物；利用常规柱色谱，对转化物进行分离，得鼠李素单体。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：杨官娥，胡嘉琳，郑庆红，胡超男，杨飞，张肇铭，
申请(专利权)人：山西医科大学，
类型：发明
国别省市：山西,14