一种利用海洋真菌大规模生产penicilone类化合物的方法技术

本发明专利技术属于海洋真菌次级代谢产物领域，具体涉及一种利用海洋真菌大规模生产penicilone类化合物的方法。本发明专利技术利用海洋真菌Penicillium sp.HK1‑6制备penicilones A‑D，每升发酵液中可分离得到几十毫克penicilone A、B，而且本发明专利技术制备方法简便易行，利于工业化大生产，利用100L的发酵罐生产，产量可达克级以上，有效地解决了penicilones A‑D的来源问题，有利于penicilones类药物的开发。

【技术实现步骤摘要】
一种利用海洋真菌大规模生产penicilone类化合物的方法
本专利技术属于海洋真菌次级代谢产物领域，具体涉及一种利用海洋真菌大规模生产penicilone类化合物的方法。
技术介绍
先前专利技术人从海洋真菌Penicilliumsp.HK1-6中分离得到系列penicilone类化合物——penicilonesA-D，并发现penicilonesA-D对耐药菌(如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和耐万古霉素的肠球菌)显示出很强的抗菌活性，表明penicilonesA-D具有被开发为抗耐药菌药物的良好前景。为了解决penicilonesA-D的药源问题，专利技术人对海洋真菌Penicilliumsp.HK1-6的发酵、分离条件进行了优化，得到了一种可大规模制备penicilonesA-D的方法。
技术实现思路
海洋真菌Penicilliumsp.HK1-6的菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年7月5日；保藏编号：CGMCCNo.12762；分类命名：青霉Penicilliumsp.。菌株保藏信息可参见，在先中国专利技术专利申请(申请号CN201610831163.3)。本专利技术所述的海洋真菌Penicilliumsp.HK1-6来源于红树林根际土壤(参见：中国专利申请CN201610831163.3)。PenicilonesA-D(即化合物1-4)，结构如下：本专利技术提供一种制备化合物1-4的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)先在菌种培养基中对海洋真菌Penicilliumsp.HK1-6进行菌种培养；(2)再在发酵培养基中对步骤(1)中的海洋真菌Penicilliumsp.HK1-6进行发酵培养；(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用有机溶剂A萃取1～5次，优选3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用有机溶剂B浸提1～5次，优选3～5次，合并浸提液后减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏后，经过减压硅胶柱层析，所述减压硅胶柱层析采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱剂中石油醚所占的体积百分比依次为100％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％，每个梯度洗脱3-6个柱体积，并将其按照极性大小分成10个组分Fr.1～Fr.10(即100％石油醚洗脱为组分Fr.1，80％石油醚洗脱为组分Fr.2，依此类推，0％石油醚洗脱组分为Fr.10)；(4)组分Fr.4先经SephadexLH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl3∶MeOH＝1∶1，再经ODS反相硅胶柱层析，洗脱剂为MeOH∶H2O＝85∶15，最后得到化合物4；组分Fr.5先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6至1∶3或者甲醇∶二氯甲烷＝1∶30至1∶15，再经高效液相色谱HPLC制备(所用色谱柱为AgilentC18，9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为MeOH∶H2O＝85∶15)，得化合物2；组分Fr.8先经SephadexLH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl3∶MeOH＝1∶1，再经ODS反相硅胶柱层析，洗脱剂MeOH∶H2O＝75∶25，最后经高效液相色谱HPLC制备(所用色谱柱为AgilentC18，9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为MeOH∶H2O＝85∶15)，分别得到化合物1和3。本专利技术制备方法中涉及洗脱剂、流动相等比例的均指体积比。其中所述菌种培养基和发酵培养基各自独立地选自液体或固体的GPY培养基、或液体或固体的PDA培养基。固体PDA培养基：每1000mL水中，土豆200g(煮沸取汁)，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g，琼脂12-20g。液体PDA培养基：每1000mL水中，土豆200g(煮沸取汁)，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g。固体GPY培养基：每1000mL水中，蛋白胨3-5g，酵母膏1-2g，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g，琼脂12-20g。液体GPY培养基：每1000mL水中，蛋白胨3-5g，酵母膏1-2g，葡萄糖15-20g，海水素(或粗海盐)20-40g。本专利技术上述制备方法中，所述的有机溶剂A优选乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或乙醚中的一种或几种；所述的有机溶剂B优选甲醇、乙醇、THF或丙酮中的一种或几种。本专利技术上述制备方法步骤(1)中菌种培养温度优选为15-25℃；培养时间优选为2-10天，进一步优选为3、5、7天，菌种培养方式选自静置培养或摇床培养；步骤(2)中发酵培养温度优选为15-30℃，进一步优选20-25℃；培养时间优选为20-40天，进一步优选21、24、28、30、32、35天，发酵培养方式选自静置培养或摇床培养；步骤(4)中所述的正相硅胶柱层析中采用的固定相的硅胶目数为100～200目、200～300目或300～400目，优选200～300目。本专利技术的优点在于利用海洋真菌Penicilliumsp.HK1-6制备penicilonesA-D，每升发酵液中可分离得到几十毫克peniciloneA、B，而且本专利技术制备方法简便易行，利于工业化大生产，利用100L的发酵罐生产，产量可达克级以上，有效地解决了penicilonesA-D的来源问题，有利于penicilones类药物的开发。附图说明图1化合物3的1HNMR(600MHz，CDCl3)图；图2化合物3的13CNMR(150MHz，CDCl3)图；图3化合物3的HSQC(CDCl3)图；图4化合物3的1H-1HCOSY(CDCl3)图；图5化合物3的HMBC(CDCl3)图；图6化合物3的NOESY(CDCl3)图；图7化合物4的1HNMR(600MHz，CDCl3)图；图8化合物4的13CNMR(150MHz，CDCl3)图；图9化合物4的HSQC(CDCl3)图；图10化合物4的1H-1HCOSY(CDCl3)图；图11化合物4的HMBC(CDCl3)图；图12化合物4的NOESY(CDCl3)图。具体实施方式为了便于对本专利技术的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解专利技术而并非用来限定本专利技术的范围或实施原则，本专利技术的实施方式不限于以下内容。实施例1(1)海洋真菌Penicilliumsp.HK1-6菌种的培养真菌Penicilliumsp.(HK1-6)的菌种培养所用的培养基为固体PDA培养基(每1000mL水中加入：土豆200g煮沸取汁，葡萄糖15g，海水素30g，琼脂12g)；使用时倒入玻璃培养皿中，制成培养基平板。真菌菌株Penicilliumsp.(HK1-6)接种于培养基平板中，在25℃下摇床培养5天。(2)海洋真菌Penicilliumsp.HK1-6的发酵真菌Penicilliumsp.HK1-6的发酵培养所用的发酵培养基为液体PDA培养基，每1000mL水中加入：土豆200g煮沸取汁，葡萄糖20g，海水素35g；使用时分装于锥形瓶中。真菌菌株接种于锥形瓶的培养基中，于15-20℃静置培养28天本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备化合物1‑4的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)先在菌种培养基中对海洋真菌Penicillium sp.HK1‑6进行菌种培养；(2)再在发酵培养基中对步骤(1)中的海洋真菌Penicillium sp.HK1‑6进行发酵培养；(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用有机溶剂A萃取1～5次，优选3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用有机溶剂B浸提1～5次，优选3～5次，合并浸提液后减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏后，经过减压硅胶柱层析，所述减压硅胶柱层析采用石油醚‑乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱剂中石油醚所占的体积百分比依次为100％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％，每个梯度洗脱3‑6个柱体积，并将其按照极性大小分成10个组分Fr.1～Fr.10；(4)组分Fr.4先经Sephadex LH‑20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl3∶MeOH＝1∶1，再经ODS反相硅胶柱层析，洗脱剂为MeOH∶H2O＝85∶15，最后得到化合物4；组分Fr.5先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6至1∶3或者甲醇∶二氯甲烷＝1∶30至1∶15，再经高效液相色谱HPLC制备，得化合物2；组分Fr.8先经Sephadex LH‑20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl3∶MeOH＝1∶1，再经ODS反相硅胶柱层析，洗脱剂MeOH∶H2O＝75∶25，最后经高效液相色谱HPLC制备，分别得到化合物1和3；化合物1‑4的结构如下：...

【技术特征摘要】
2017.02.04 CN 20171006500221.一种制备化合物1-4的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)先在菌种培养基中对海洋真菌Penicilliumsp.HK1-6进行菌种培养；(2)再在发酵培养基中对步骤(1)中的海洋真菌Penicilliumsp.HK1-6进行发酵培养；(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液用有机溶剂A萃取1～5次，优选3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到发酵液浸膏；菌体用有机溶剂B浸提1～5次，优选3～5次，合并浸提液后减压浓缩得到菌体浸膏；合并发酵液浸膏和菌体浸膏后，经过减压硅胶柱层析，所述减压硅胶柱层析采用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，洗脱剂中石油醚所占的体积百分比依次为100％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％，每个梯度洗脱3-6个柱体积，并将其按照极性大小分成10个组分Fr.1～Fr.10；(4)组分Fr.4先经SephadexLH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl3∶MeOH＝1∶1，再经ODS反相硅胶柱层析，洗脱剂为MeOH∶H2O＝85∶15，最后得到化合物4；组分Fr.5先经正相硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6至1∶3或者甲醇∶二氯甲烷＝1∶30至1∶15，再经高效液相色谱HPLC制备，得化合物2；组分Fr.8先经SephadexLH-20凝胶柱层析，洗脱剂为CHCl3∶MeOH＝1∶1，再经ODS反相硅胶柱层析，洗脱剂MeOH∶H2O＝75∶25，最后经高效液相色谱HPLC制备，分别得到化合物1和3；化合物1-4的结构如下：2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述菌种培养基和发酵培养基各自独立地选自液体或固体的GPY培养基、或液体或固体的PDA培养基。3.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈敏，沈南星，张奉民，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32