一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术应用基因工程方法，替换谷氨酸棒杆菌RG中IDH编码基因icdCg为变异链球菌中IDH编码基因icdSm，从而调节其对不同氧化还原辅因子的亲和力，解决L‑赖氨酸合成过程中胞内氧化还原失衡问题，提高菌株积累L‑赖氨酸能力。重组菌经上罐实验(5L发酵罐)，L‑赖氨酸积累量达121.4g/L。此发明专利技术成功改变了谷氨酸棒杆菌中IDH的氧化还原辅因子亲和力，解决了L‑赖氨酸合成过程中胞内氧化还原失衡问题，为选育L‑赖氨酸高产菌株提供崭新的思路。

【技术实现步骤摘要】
一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法
本专利技术涉及一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法，属于基因工程

技术介绍
L-赖氨酸是人类和动物所必需的、自身不能合成的八大必需氨基酸之一。由于L-赖氨酸具有多种生理功能，如平衡氨基酸组成、调节体内代谢平衡、提高机体对谷类蛋白质的吸收及利用率和促进机体生长发育等，因此广泛应用于饲料工业、医药工业及食品工业中。L-赖氨酸生产方法主要有三种：蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业生产L-赖氨酸的主要方法。因此，选育具有自主知识产权的、高生产效率的、低副产物积累的L-赖氨酸生产菌株，对拓宽产品应用范围和提高利润空间，实现企业可持续发展具有重要意义。研究报道，多种微生物可以用于生产L-赖氨酸，其中国内外用于工业化生产L-赖氨酸的菌株多为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)及其亚种和大肠杆菌(Escherichiacoli)的工程菌株。以葡萄糖为原料时，C.glutamicum中有5个途径参与L-赖氨酸合成：糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸(TCA)循环、补给途径(CO2固定反应)和L-赖氨酸终端合成途径(图1所示)。需要指出的是，C.glutamicum中每合成1molL-赖氨酸需要消耗4molNADPH。因此，为了提高C.glutamicum生物合成途径中L-赖氨酸的积累，提高C.glutamicum代谢途径中NADPH量或降低L-赖氨酸合成途径中NADPH需求量是非常重要的策略。然而，我们前期研究发现，胞内过量的NADPH会阻碍细胞对糖的利用，降低菌体生长量和L-赖氨酸积累量，其原因是胞内过量的NADPH打破了胞内氧化还原平衡，从而限制了菌体生长和合成途径中关键酶活力。因此，维持胞内氧化还原平衡，对提高L-赖氨酸积累具有重要意义。异柠檬酸脱氢酶(Isocitratedehydrogenase,IDH)在生物体内有两种形式，即以NAD+为电子受体的NAD+-依赖型IDH(NAD-IDH)和以NADP+为电子受体的NADP+-依赖型IDH(NADP-IDH)。NAD-IDH主要存在于真核生物线粒体中，也存在少数的细菌和古细菌等原核生物中，如嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、变异链球菌(Streptococcusmutans)等。NAD-IDH在TCA循环中主要催化异柠檬酸氧化脱羧，生成CO2和α-酮戊二酸，同时还生成还原态辅酶NADH，所生成的NADH再通过氧化呼吸链产生大量的ATP，直接用于机体的供能。NADP-IDH广泛存在于真核生物各个细胞器(如叶绿体、线粒体、过氧化物酶体以及胞质)和原核细胞中。NADP-IDH在TCA循环中虽然也是催化异柠檬酸氧化脱羧生成CO2和α-酮戊二酸，但同时生成的是还原态辅酶NADPH，用于维持细胞内的还原状态以增强细胞抗氧化应激的能量，并且提供还原力以进行维生素、氨基酸等物质的生物合成。不同细菌的IDH对NAD+和NADP+的亲和力也不同，如E.coli中IDH对NADP+的亲和性是对NAD+亲和性的7000倍，而S.mutans中IDH在以NADP+为辅因子时不表现出酶活力。和其他已发现的生物体中的IDH一样，C.glutamicum中IDH由基因icd编码，催化异柠檬酸氧化脱羧生成CO2和α-酮戊二酸，同时生成还原态辅酶NADPH。现有的谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸产量不高主要是由于NADPH含量不足，从而限制了L-赖氨酸的进一步增加，本实验室尝试将菌株中NAD+-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,NAD-GADPH)替换成来源于丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)中的NADP-GADPH，所获得的重组菌株虽然在一定程度上增加L-赖氨酸产量，但是由于胞内NADH不足以及积累了过多的NADPH，从而限制菌体生长、糖的利用率以及L-赖氨酸生产效率。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种合成L-赖氨酸能力提高的谷氨酸棒杆菌。为了解决上述技术问题，本专利技术将重组菌株C.glutamicumRG中NADP-IDH替换成来源于S.mutans中NAD-IDH，获得重组菌株。该重组菌株提高了IDH对NAD+的亲和力而降低了对NADP+的亲和力，在一定程度上增加了胞内NADH的合成，同时解除了C.glutamicumRG发酵生产L-赖氨酸过程中NADPH供应过剩的缺点，提高了菌株合成L-赖氨酸的能力。本专利技术的第一个目的是提供一种提高谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸产量的方法，所述方法是将谷氨酸棒杆菌中NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶替换为变异链球菌来源的NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶。本专利技术的第二个目的是提供一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌将谷氨酸棒杆菌RG(C.glutamicumRG)中NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)替换为变异链球菌(S.mutans)来源的NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)。在本专利技术的一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌RG的构建方法是将谷氨酸棒杆菌中NAD+-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NAD-GADPH)替换成来源于丙酮丁醇梭菌中的NADP-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NADP-GADPH)。在本专利技术的一种实施方式中，所述NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌是以pK18-MBPMT作为载体。本专利技术的第三个目的是提供所述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，所述方法具体是：(1)S.mutans中NAD-IDH编码基因icdSm的获得根据S.mutansUA159icd的核苷酸序列，在其基因上下游加入限制性内切酶XmaIII酶切位点序列，通过基因合成获得含有目的基因的重组质粒pUC57/icdSm；(2)整合型载体pK18-MBPMT/ΔicdCg的构建根据C.glutamicumATCC13032icd基因序列设计icdCg基因上下游以及中间引物，以C.glutamicumRG基因组为模板，进行PCR，获得在3’端和5’端有相同限制性内切酶XmaIII的PCR产物，将以上述PCR产物与整合型载体pK18-MBPMT相连构建重组质粒pK18-MBPMT/ΔicdCg；(3)重组菌C.glutamicumRGI的构建通过XmaIII酶酶切回收icdSm片段，将icdSm片段与同样经过XmaIII酶酶切后的pK18-MBPMT/ΔicdCg整合型载体相连构建重组质粒pK18-MBPMT/ΔicdCg::icdSm，电击转化C.glutamicumRG，筛选获得重组菌C.glutamicumRGI。本专利技术的第四个目的是提供所述重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L-赖氨酸的方法，所述方法是将重组菌C.glutamicumRGI接种到种子培养基中，28-32℃，800-1200r·mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高谷氨酸棒杆菌L‑赖氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法是将谷氨酸棒杆菌中NADP+‑依赖型异柠檬酸脱氢酶替换为变异链球菌来源的NAD+‑依赖型异柠檬酸脱氢酶。

【技术特征摘要】
1.一种提高谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸产量的方法，其特征在于，所述方法是将谷氨酸棒杆菌中NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶替换为变异链球菌来源的NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶。2.一种L-赖氨酸产量提高的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒杆菌是利用权利要求1所述的方法获得，所述重组谷氨酸棒杆菌将谷氨酸棒杆菌RG中NADP+-依赖型异柠檬酸脱氢酶替换为变异链球菌来源的NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶。3.根据权利要求2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌RG的构建方法是将谷氨酸棒杆菌中NAD+-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶替换成来源于丙酮丁醇梭菌中的NADP-依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶。4.根据权利要求2～3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述NAD+-依赖型异柠檬酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.根据权利要求2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述重组菌是以pK18-MBPMT作为载体。6.权利要求2～5任一所述的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)S.mutans中NAD-IDH编码基因icdSm的获得根据S.mutansUA159icd的核苷酸序列，在其基因上下游加入限制性内切酶XmaIII酶切位点序列，通过基因合成获得含有目的基因的重组质粒pUC57/icdSm；(2)整合型载体pK18-MBPMT/ΔicdCg的构建根据C.glutamicumATCC13032icd基因序列设计icdCg基因上下游以及中间引物，以C.glutamicumRG基因组为模板，进行PCR，获得在3’端和5’端有相同限制性内切酶XmaIII的PCR产物，将以上述PCR产物与整合型载体pK18-MBPMT相连构建重组质粒pK18-MBPMT/ΔicdCg；(3)重组菌C.glutamicumRGI的构建通过XmaIII酶酶切回收icdSm片段，将icd...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建中，张伟国，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32