一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱‑质谱方法，该方法包括如下步骤：（1）检测条件；（2）样品处理；（3）图谱分析；(4)标准血氨样品的制备；（5）含量计算。本方法通过柱前衍生化气相色谱‑质谱联用法，能够有针对性的检测出生物样品中的氨含量，是临床检验血氨光谱法的补充，可以有效降低检血凝固状况和溶血对检测结果的影响。提高了检测的灵敏度，同时大大简化了检测步骤，节省了时间和成本。
A derivative gas chromatography-mass spectrometry method for the determination of ammonia in biological samples
A Derivatization Gas chromatography-mass spectrometry method for the determination of ammonia in biological samples is described. The method comprises the following steps: (1) detection conditions; (2) sample processing; (3) Atlas analysis; (4) preparation of standard blood ammonia samples; (5) content calculation. This method can be used to determine the content of ammonia in biological samples by Pre-column Derivatization Gas Chromatography-Mass spectrometry. It is a supplement to clinical ammonia spectrometry and can effectively reduce the coagulation status and the influence of hemolysis on the detection results. The sensitivity of the detection is improved, and the detection steps are greatly simplified, and time and cost are saved.
【技术实现步骤摘要】
一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法
本专利技术属于生物材料检测领域，具体涉及一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法。
技术介绍
以血氨(Bloodammonia，BAN)为代表的生物样品中的氨是非蛋白氮重要的化学表现形式。血氨的来源包括内源性：体内代谢产生的氨称为内源性氨，主要来自氨基酸的脱氨基作用；部分来自肾小管上皮细胞中谷氨酰胺分解产生的氨；胺类的分解也可产生氨；服用胺类药物。外源性：由消化道吸收人体内的氨称为外源性氨，如肠道内未被消化的蛋白质和未被吸收的氨基酸，经肠道细菌作用产生的氨；血中尿素扩散到肠道，经细菌尿素酶作用水解生成的氨。氨是有毒物质，人体内的氨通过以下途径解毒:①肝内经鸟氨酸循环合成尿素，经肾脏排出体外；②转变为氨基酸上的氨基；③在肾脏泌氨中与肾小管腔中的H+形成铵盐，随尿排出体外。肝脏将氨合成尿素，是保证血氨正常的关键。当肝脏功能严重损伤时，氨不能被解毒，在中枢神经系统聚集，会引起肝性脑病。现在普遍采用的临床检验血氨的方法为酶法。利用酶反应中NH4+与NADPH的等摩尔消耗关系。用分光光度计波长340nm，监测吸光度下降速率，即NADPH消耗速率，与标准管比较，可计算出血浆氨含量。这是一种间接的测定方法，且受到光谱测定法固有局限性的干扰。在溶血的情况下，不能准确测定。同时血浆中LDH、AST等也能利用NADPH，影响血浆氨测定结果的准确性。干扰因素较多。血氨和尿氨是临床评价非蛋白氮的重要指标之一。人的血氨浓度的正常值范围比尿素氮(尿素)低的多，为18-72μmol/L。换算成法医毒物分析常用质量单位为306-1224ng/ml，上限即约为1.22μg/ml。肝昏迷患者的血氨值会大幅度突破上限。申请人在严重肝病死者的血中检出了20μg/ml以上的氨。因此，研制开发一种可快速准确的检测生物样品中氨的方法一直是亟待解决的新课题。
技术实现思路
本专利技术提供一种准确的检测生物样品中氨的方法，通过柱前衍生化气相色谱-质谱联用法，能够有针对性的检测出生物样品中的氨含量，而不是间接的检测，可排除许多外界因素的干扰，提高了检测的灵敏度，同时大大简化了检测步骤，节省了时间和成本。本专利技术的目的是这样实现的：一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法，该方法包括如下步骤：(1)检测条件：气质联用仪：采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)；色谱柱：HP-5ms毛细管柱，规格：30m×0.25mm，0.25μm；电子离子轰击源(EI源，70eV)，全离子扫描，扫描质量范围为40amu～600amu；载气为高纯氦气(99.9％)，流速1.0ml/min；升温程序：初始柱温为60℃，保持1min，以15℃/min升温至180℃,保持8min，再以30℃/min升温至260℃,进样口温度为265℃，离子源温度为230℃；(2)样品处理：精密称取生物样品0.5g于10ml规格的试管内，加入1MNaOH(pH＝14)溶液0.5ml，加入七氟丁酰氯衍生化试剂10μl，漩涡震荡30s后，微波1min，加入乙酸乙酯2.0ml震荡1min，3500转离心10min，用移液器取出1.5ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1ml体积后进样GC-MS检测分析；(3)图谱分析：衍生化产物七氟丁酰胺，保留时间3.25min，特征质量数为m/z166(分子离子峰)、m/z194、m/z214、m/z146、m/z100、m/z69和m/z44(基峰)；(4)标准血氨样品的制备：稀释标准氨溶液浓度(500μg/ml)，用去氨蒸馏水定容于100ml规格容量瓶中。分别向0.5ml正常人新鲜静脉血中添加不同浓度的氨标准液，制作成质量浓度分别为1、10、50、100和200μg/ml的标准工作曲线样品溶液。(5)含量计算：将步骤(4)中制成的标准工作曲线样品溶液按照步骤(2)中样品处理的方法进行处理后进样分析。选择检测m/z166的选择离子色谱图，以衍生化产物七氟丁酰胺的峰面积为纵坐标，以血中添加氨的质量浓度为横坐标，计算回归方程得到y＝82815x+63766，R2＝0.9877。计算含量时，将待测样品中七氟丁酰胺的峰面积代入回归方程即得到待测样品含量。该检测方法所使用的生物材料为尿液、胃内容物或血浆样品。该方法的最低检出限以S/N＝3进行计算，对于血氨的最低检出限为0.2μg/ml，定量限为1.0μg/ml。与现有技术相比，具有如下有益效果。1、检测原理为直接测定生物样品中的氨，而非间接测定。2、采用的是衍生化后的质谱法，而非传统的光谱法。可将血液凝固状态、溶血、试剂干扰等一些外界影响因素有效降低。3、所用到的试剂种类更少，操作简单快速。4、可检测的生物材料包括尿液、胃内容物或血浆样品。附图说明图1血氨衍生化反应示意图。图2衍生化产物七氟丁酰胺典型质谱图。图3衍生化产物七氟丁酰胺典型色谱图。图4空白血加氨标准曲线。具体实施方式实施例1衍生化反应相关条件的优化。1.对衍生化反应pH值的考察：酰氯和胺(氨)反应生成酰胺，需要在碱性条件下进行，产物中生成氯化氢，加入缚酸剂可提高反应效率，本研究对pH＝9以上的碱性条件进行考察。认为一个较强的碱性条件有助于产物的稳定。实验过程如下：精密称取0.5ml全血于10ml规格的试管内，分别加入pH为9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0的硼酸缓冲溶液(用NaOH调节缓冲液的pH值)0.5ml。加入七氟丁酰氯衍生化试剂10μl。漩涡振荡30s后，微波1min。加入乙酸乙酯2.0ml振荡1min，3500转离心10min，用移液器取出1.5ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1ml体积后进样GC-MS检测分析，结果见表1。表1不同碱性条件下衍生化反应进行程度结果表明：随着反应溶液pH值的增加，反应产物生成量增加。这可能是由于强碱性溶液中的OH-能够与反应产生的HCl中和，促进反应向正向进行从而使反应产率增加。2.对衍生化振荡时间的考察实验过程如下：精密称取0.5ml全血于10ml规格的试管内，加入1MNaOH溶液0.5ml。加入七氟丁酰氯衍生化试剂10μl。分别漩涡振荡反应30s、1min、5min、10min、20min后，微波1min。加入乙酸乙酯2.0ml振荡1min，3500转离心10min，用移液器取出1.5ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1ml体积后进样GC-MS检测分析，结果见表2。表2振荡时间对衍生化程度的影响结果表明：衍生化反应通常预留出一定的反应时间，加入衍生化试剂后随即进行下一步操作的情况并不多见。申请人对20min以内的衍生化时间进程进行了考察，并没发现产率的明显提高。申请人默认为衍生化反应是瞬间完成的，因此申请人将反应的时间设定为30s。3.对衍生化反应温度的考察实验过程如下：精密称取0.5ml全血于10ml规格的试管内，加入1MNaOH溶液0.5ml。加入七氟丁酰氯衍生化试剂10μl。分别于20℃、30℃、40℃、50℃条件下漩涡振荡反应30s后，微波1min。加入乙酸乙酯2.0ml振荡1min，3500转离心10min，用移液器取出1.5ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1ml体积后进样GC-MS检测分析，结果见表3。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱‑质谱方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：检测条件：气质联用仪：采用气相色谱‑质谱联用仪；色谱柱：HP‑5ms毛细管柱，规格：30 m×0.25 mm，0.25 μm；电子离子轰击源(EI源，70 eV)，全离子扫描，扫描质量范围为40 amu～600 amu；载气为高纯氦气(99.9%)，流速1.0 ml/min；升温程序：初始柱温为60 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升温至180℃,保持8 min，再以30 ℃/min升温至260 ℃, 进样口温度为265 ℃，离子源温度为230 ℃；（2）样品处理：精密称取生物样品0.5 g于10 ml规格的试管内，加入1M NaOH（pH=14）溶液0.5 ml，加入七氟丁酰氯衍生化试剂10 µl，漩涡震荡30s后，微波1min，加入乙酸乙酯2.0 ml震荡1 min，3500转离心10 min，用移液器取出1.5 ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1 ml体积后进样GC‑MS检测分析；(3) 图谱分析：衍生化产物七氟丁酰胺，保留时间3.25 min，特征质量数为m/z 166（分子离子峰）、m/z194、m/z 214、m/z 146 、m/z 100、 m/z 69 和m/z 44（基峰）；（4）标准血氨样品的制备：稀释标准氨溶液浓度(500 µg/ml)，用去氨蒸馏水定容于100 ml规格容量瓶中，分别向0.5ml正常人新鲜静脉血中添加不同浓度的氨标准液，制作成质量浓度分别为1、10、50、100和200 µg/ml的标准工作曲线样品溶液；（5）含量计算：将步骤（4）中制成的标准工作曲线样品溶液按照步骤（2）中样品处理的方法进行处理后进样分析，选择检测m/z166的选择离子色谱图，以衍生化产物七氟丁酰胺的峰面积为纵坐标，以血中添加氨的质量浓度为横坐标，计算回归方程得到 y = 82 815x + 63 766，R2=0.9 877，计算含量时，将待测样品中七氟丁酰胺的峰面积代入回归方程即得到待测样品含量。...
【技术特征摘要】
1.一种检测生物样品中氨含量的衍生化气相色谱-质谱方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：检测条件：气质联用仪：采用气相色谱-质谱联用仪；色谱柱：HP-5ms毛细管柱，规格：30m×0.25mm，0.25μm；电子离子轰击源(EI源，70eV)，全离子扫描，扫描质量范围为40amu～600amu；载气为高纯氦气(99.9%)，流速1.0ml/min；升温程序：初始柱温为60℃，保持1min，以15℃/min升温至180℃,保持8min，再以30℃/min升温至260℃,进样口温度为265℃，离子源温度为230℃；（2）样品处理：精密称取生物样品0.5g于10ml规格的试管内，加入1MNaOH（pH=14）溶液0.5ml，加入七氟丁酰氯衍生化试剂10µl，漩涡震荡30s后，微波1min，加入乙酸乙酯2.0ml震荡1min，3500转离心10min，用移液器取出1.5ml具刻度尖底小瓶内，用氮气吹至0.1ml体积后进样GC-MS检测分析；(3)图谱分析：衍生化产物七氟丁酰胺，保留时间3.25min，特征质量数为m/z166（分子离子峰）、m/z194、m/z214、m/z14...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁慧雅，刘俊亭，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。