一种用于检测铜离子的特异性荧光探针、方法及试剂盒技术

本发明专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种用于检测铜离子的特异性荧光探针、方法及试剂盒，所述铜离子荧光探针核酸序列，所述核酸序列至少包括18个核苷酸，所述核酸序列的3’端修饰叠氮基团、5’端修饰荧光基团。本发明专利技术使用单链核酸，且对组成所述核酸的碱基排列无要求，经济可行，制备简便；用具有一定长度的核酸序列连接叠氮基团与荧光基团，使叠氮基团与荧光基团之间具有一定的间距，二者不会互相影响，而只发射荧光基团的荧光，大大降低了背景机制的影响，提高了所述荧光探针检测的准确性。

A specific fluorescent probe, method and kit for detecting copper ions

The invention belongs to the field of analytical chemistry, in particular to a specific fluorescent probe, method and reagent kit for detecting copper ions. The copper ion fluorescent probe nucleic acid sequence comprises at least 18 nucleotides. The nucleic acid sequence has 3'end modified azide group and 5'end modified fluorescent group. The invention uses single-stranded nucleic acid and has no requirement on the base arrangement of the nucleic acid, is economical and feasible, and is easy to prepare; the azide group and the fluorescent group are connected with a certain length of nucleic acid sequence, so that there is a certain distance between the azide group and the fluorescent group, and the two groups will not affect each other, but only emit fluorescent group. Fluorescence greatly reduces the influence of background mechanism and improves the accuracy of the fluorescent probe detection.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测铜离子的特异性荧光探针、方法及试剂盒
本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种用于检测铜离子的特异性荧光探针、方法及试剂盒。
技术介绍
铜元素是生物体内所必需的一种微量重金属元素和必需的营养素，在细胞中的含量仅次于铁和锌，而铜离子是铜元素的重要存在形式，在各种有机体的基本生理过程中均发挥着重要作用，如作为金属酶(如细胞色素氧化酶、过氧化物歧化酶、酪氨酸酶、多巴胺β-羟化酶、赖氨酰氧化酶和铜蓝蛋白等二十多种酶类)的催化辅助因子的形式，广泛参与生命体系中电子传递、氧化还原等一系列过程，在生物体内的酶反应、酶转录以及一些氧化还原过程发挥重要的作用。人体血液中铜离子的正常含量为100～150μg/dL(15.7～23.6μmol/L)，合适含量的铜离子是生物体维持正常工作的基本保证，如果生物体内的铜离子含量偏小，会导致生长和代谢的紊乱，而含量过多同样也会对生物体产生巨大的毒害作用。铜离子过量通常是由于环境中重金属离子污染造成的，通过食物链在生物体富集，影响肝肾的正常代谢，造成神经退行性疾病以及引发癌症。为此，我国规定生活饮水中铜离子含量不得超过1.0mg/L，城镇污水处理厂排放标准中铜含量不得超过0.5mg/L。因此，对铜离子进行检测以控制其含量具有十分重要的意义。目前检测铜离子浓度的方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体-质谱法、电感耦合等离子体-原子发射光谱法、石英晶体微天平检测技术、电化学技术等。这些技术虽然有一定的灵敏度和特异性，但仪器比较贵重且需要专业人员操作，检测耗费较大，难以在铜离子的检测中普及应用。荧光检测方法由于具有较高的灵敏度和选择性且使用方便等优点，成为学者们研究的热点，并已被广泛应用于铜离子的检测。中国专利文献CN107064515A公开了一种基于点击化学的铜离子检测方法及检测试剂盒，二价铜离子在还原剂作用下被还原成一价铜离子，从而激活点击化学反应，连接两段核酸序列，磁珠分离后可进一步组装具有催化活性的催化型核酸结构，可切断底物核酸，从而使底物核酸两段的荧光基团和淬灭基团分离，通过荧光检测鉴定铜离子浓度，该方法具有较高的灵敏度和特异性，对铜离子的检测限为2pM。然而，上述公开的技术需要使用多种核酸序列，且每种核酸序列的碱基排布均有严格的要求，从而导致检测成本高；此外，该技术的检测方法包括多个步骤，有的步骤甚至需要严格规定反应温度及时间，如需要在95℃加热5min后立即冰浴10min，反应条件苛刻，操作不简便，耗时过长(需要220分钟)，并且还容易受到外界环境干扰，严重影响了上述方法的可重复性和稳定性。综上，上述技术在检测铜离子时存在着操作繁琐、耗时长、经济性和稳定性较差的问题。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的是现有的铜离子检测方法所存在的操作繁琐、耗时长、经济性和稳定性差的问题，从而提供一种操作简单、快捷、经济可行且稳定性好的铜离子检测方法。进一步地，本专利技术还提供了一种用于上述检测方法的铜离子特异性荧光探针及包含其的试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种铜离子荧光探针，所述铜离子荧光探针包括核酸序列，所述核酸序列至少包括18个核苷酸，所述核酸序列的3’端修饰叠氮基团、5’端修饰荧光基团。进一步地，所述荧光基团源自荧光素类化合物。更进一步地，所述荧光素类化合物为羧基荧光素、异硫氰酸荧光素或四氯荧光素。进一步地，所述核酸序列的5’端向3’端延伸的过程中包含ATACCAGCTTATTCAATT碱基序列。本专利技术还提供了一种铜离子的检测方法，包括以下步骤：(1)在pH＝7.0～8.0的水溶液中，将权利要求1-4任一项所述的铜离子荧光探针与还原剂混合均匀；(2)将含铜(II)离子的待测液加入至步骤(1)的体系中，混匀后并进行荧光检测。进一步地，步骤(1)中，所述pH＝7.0～8.0的水溶液为磷酸盐缓冲溶液。进一步地，在步骤(1)的体系中，所述铜离子荧光探针的物质的量浓度为10μmol/L。进一步地，所述还原剂选自抗坏血酸钠、维生素C、柠檬酸盐中的一种或多种。进一步地，步骤(2)中所述待测液中铜(II)离子的物质的量浓度为15～450ng/mL。进一步地，步骤(2)中，在将含铜(II)离子的待测液加入至步骤(1)的体系中前还包括将至少3种不同铜(II)离子浓度的标准液分别加入至步骤(1)的体系中，并根据检测结果绘制铜离子浓度与荧光强度值的标准曲线图。进一步地，步骤(2)中，荧光激发波长为480nm。进一步地，步骤(1)中还包括，向所述pH＝7.0～8.0的水溶液中加入三唑类化合物的步骤。进一步地，所述三唑类化合物与所述待测液中铜(II)离子物质的量比为(178～5300)：1。更进一步地，所述三唑类化合物为三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺和/或三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺。本专利技术还提供了一种铜离子检测试剂盒，包括上述的铜离子荧光探针、pH＝7.0～8.0的水溶液与还原剂。进一步地，所述铜离子检测试剂盒还包括三唑类化合物。本专利技术提供的铜离子检测方法的工作原理为：采用具有一定长度的核酸序列连接叠氮基团与荧光基团，使两者之间具有一定的间距而不会互相影响，当有Cu2+存在时，Cu2+首先靠近叠氮基团并与其结合，随之，还原剂(以抗坏血酸钠为例)将Cu2+还原为不稳定的Cu+，而后Cu+与两分子核酸序列形成不稳定的三配位配合物，导致体系的荧光强度降低，由此可达到检测铜(II)离子的目的。当体系中同时存在三唑类化合物(以三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺，TBTA为例)时，Cu+会被三唑类化合物捕捉，如图1所示，形成以Cu+为配位中心、一分子三唑类化合物及两分子核酸序列为配体的稳定配合物，在该配合物中，由于Cu+与荧光基团的距离被拉近，进而淬灭了荧光基团的荧光。本专利技术的技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的铜离子荧光探针，所述荧光探针为两端分别修饰了叠氮基团和荧光基团的核酸序列，所述核酸序列至少包括18个核苷酸，使用单链核酸，且对组成所述核酸的碱基排列无要求，经济可行，制备简便；用具有一定长度的核酸序列连接叠氮基团与荧光基团，使叠氮基团与荧光基团之间具有一定的间距，二者不会相互影响，而只发射荧光基团的荧光，大大降低了背景机制的影响，提高了所述荧光探针检测的准确性。2.本专利技术提供的铜离子荧光探针，选用特定的荧光素作为荧光基团，其具有高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性，Stokes位移较大，有效消除了常规荧光化合物具有自淬灭现象；此外，本专利技术中的荧光素荧光发射波长位于520nm左右，属于长波长区，可避免复杂体系的短波长区背景荧光的干扰。3.本专利技术提供的铜离子的检测方法，操作简单，反应条件温和，无需复杂的标记过程及苛刻的操作环境，反应进行1min左右即可用荧光光谱仪检测结果，大大降低了检测时间和成本，有望于铜离子检测的普及应用。4.本专利技术提供的铜离子的检测方法，还包括在反应体系中加入三唑类化合物，所述三唑类化合物可通过点击化学制备得到，其能选择性捕捉Cu(I)，并与其形成配位化合物而稳定地存在于体系中，有效提高了所述检测方法的稳定性及选择性；加入的三唑类化合物与Cu(I)形成稳定化合物进而淬灭荧光，其淬灭效率超过99％，荧光淬灭效果明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种铜离子荧光探针，其特征在于，包括核酸序列，所述核酸序列至少包括18个核苷酸，所述核酸序列的3’端修饰叠氮基团、5’端修饰荧光基团。

【技术特征摘要】
1.一种铜离子荧光探针，其特征在于，包括核酸序列，所述核酸序列至少包括18个核苷酸，所述核酸序列的3’端修饰叠氮基团、5’端修饰荧光基团。2.根据权利要求1所述的铜离子荧光探针，其特征在于，所述荧光基团源自荧光素类化合物。3.根据权利要求2所述的铜离子荧光探针，其特征在于，所述荧光素类化合物为羧基荧光素、异硫氰酸荧光素或四氯荧光素。4.根据权利要求1-3任一项所述的铜离子荧光探针，其特征在于，所述核酸序列的5’端向3’端延伸的过程中包含ATACCAGCTTATTCAATT碱基序列。5.一种铜离子的检测方法，包括以下步骤：(1)在pH＝7.0～8.0的水溶液中，将权利要求1-4任一项所述的铜离子荧光探针与还原剂混合均匀；(2)将含铜(II)离子的待测液加入至步骤(1)的体系中，混匀后并进行荧光检测。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述pH＝7.0～8.0的水溶液为磷酸盐缓冲溶液。7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，在步骤(1)的体系中，所述铜离子荧光探针的物质的量浓度为10μmol/L。8.根据权利要求5-7任一项所述的检测方法，所述还原剂选自抗坏血酸钠、维生素C、柠檬酸盐中的一种或多种。9.根据权利要求5-8任一项所述的检测方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱素艳，魏益华，王冬根，罗林广，胡丽芳，张金艳，陈庆隆，
申请(专利权)人：江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36