一种生物样品的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种生物样品的检测方法，包括以下步骤：(1)对采集自受试者的生物样品进行分离，得到待测样品；和(2)在所述待测样品中检测IgG4、PLA2R、Nephrin和NPHS2中的一种或多种，检测结果作为判断所述受试者是否需要进行肾活检的初步依据。本发明专利技术提供的检测方法可以对膜性肾病进行初级筛查，为后期是否进行肾活检穿刺提供参考数据；而且该检测方法是非侵入性的，操作简便且检测费用相对较低。

A method for the detection of biological samples

The invention provides a method for detecting biological samples, which comprises the following steps: (1) separating the biological samples collected from the subjects to obtain the samples to be tested; and (2) detecting one or more of IgG4, PLA2R, Nephrin and NPHS 2 in the samples to be tested, and the detection results as a judgment of whether the subjects need to do so. Preliminary evidence for renal biopsy. The detection method provided by the invention can carry out primary screening for membranous nephropathy, and provide reference data for whether or not to carry out renal biopsy puncture in the later period; moreover, the detection method is non-invasive, easy to operate and relatively low detection cost.

【技术实现步骤摘要】
一种生物样品的检测方法
本专利技术涉及医学检验领域，具体涉及一种生物样品的检测方法。
技术介绍
我国慢性肾脏疾病(CKD)患病率为10.8％，膜性肾病(MN)是以肾小球基底膜上皮细胞下免疫复合物沉积伴基底膜增厚为特征的一组疾病，是成人肾病综合征的常见原因。膜性肾病在原发性肾小球疾病中约占6.0％-28.8％，成为继IgA肾病之后原发性肾小球疾病的第二病因，同时也是导致终末期肾脏疾病(ESRD)的重要病因。2016年南方医院侯凡凡院士团队的一项大规模研究显示，膜性肾病比例达23.4％，仅次于IgA肾病(28.1％)。根据发病原因是否明确，膜性肾病分为自发性膜性肾病(IMN)和继发性膜性肾病(SMN)。IMN是排除系统性红斑狼疮、感染、肿瘤和药物中毒等原因的原发性膜性肾病，占75％-80％。自发性膜性肾病(IMN)与继发性膜性肾病(SMN)在病因、治疗和预后等方面均有很大不同，因此对IMN和SMN的早诊断和鉴别诊断尤为重要。目前临床常用的肾脏疾病检测方法是直接进行肾脏活检，即肾穿刺检查，膜性肾病的检测和诊断也依赖于这种检查。然而，肾穿刺检查是一项较为复杂的、技术含量较高的检查方法，一般需要在三级以上医院及其相关检测机构配合进行，普及性较差。另外，肾穿刺是一种侵入性检测手段，检测存在风险，受试者遭受身体上的痛苦的同时还有可能引发内出血。而且，受试者需要住院过夜以完成检查，因而难以成为慢性疾病治疗过程中明确疗效和预后所需的多次重复性检查手段。另外进行肾穿刺的费用也较高。在中国目前医疗资源较为匮乏的背景下，受试者不得不等待数天甚至更长的时间才能被安排进行此项检查。另外，若肾脏活检的结果是患者并未患有肾病，则患者在白白遭受穿刺带来的身体痛苦和承担高额花费的同时，还可能经历内出血的风险，对身体造成二次伤害。这对患者、家属、医院三方都是潜在的负担。因此，对疑似患有肾脏疾病的患者在进行肾穿刺之前进行前期、无创(非侵入性)、低费用、快速的可靠排查是有利的。已有研究发现，自发性膜性肾病(IMN)的根本病因是针对M型磷脂酶A2受体(PLA2R)的自身抗体的存在，该M型磷脂酶A2受体在肾脏肾小球中表达。患有IMN的个体的血清中含有可检测量的这种自身抗体。根据这种自身抗体与IMN的相关性，可以利用PLA2R抗体的血清学检测作为自发性膜性肾病诊断和预后的指标。但是，临床实践表明，自发性膜性肾病患者血清PLA2R抗体阳性率仅为68.5％，仍有31.5％的特发性膜性肾病患者血清PLA2R抗体为阴性而难以有效检出。基于现有技术的上述缺陷，亟需开发出一种针对膜性肾病的高效、简单、非侵入的检测方法。
技术实现思路
本专利技术人经研究发现，膜性肾病患者体内的抗-PLA2R的自身抗体为免疫球蛋白家族(IgG)。本专利技术人还发现，在IMN患者的血液检测中，IMN患者的血清IgG水平与健康人相比明显下降，约65.75％IMN患者发生低IgG血症。而低IgG血症并非IMN的专一性指标，临床上约56.47％的低IgG血症患者被确诊为IMN，约45.53％的低IgG血症患者被确诊为微小病变(MCD)。因此，当前的膜性肾病的血液检测具有局限性。本专利技术人还发现，膜性肾病患者尿液离心沉渣分离的足细胞和细胞碎片中PLA2R及其抗体检测呈阳性，并且其中抗体IgG的存在及其含量与膜性肾病相关。本专利技术人据此专利技术出一种针对膜性肾病相关标志物的无创检测方法，该检测结果作为判断所述受试者是否需要进行肾活检的初步依据。本专利技术提供的检测方法可以作为现有肾活检方法的前期或辅助手段和/或为肾活检提供参考数据。当然，在结合或不结合其他因素的前提下，若临床医生认为本专利技术检测方法的结果足以确定受试者患有膜性肾病或受试者基于此方法或用途的结果即确信其患有肾病，也可直接进行治疗或留待观察。根据本专利技术，提供一种生物样品的检测方法，包括以下步骤：(1)对采集自受试者的生物样品进行分离，得到待测样品；和(2)在所述待测样品中检测IgG4、PLA2R、Nephrin和NPHS2中的一种或多种，检测结果作为判断所述受试者是否需要进行肾活检的初步依据。其中，所述生物样品是尿液，所述待测样品是尿液经过离心处理得到的尿液沉淀物，所述待测样品包含以下中的一种或多种：细胞、细胞碎片、以及附着在细胞或细胞碎片上的免疫复合物。其中，在步骤(2)中，通过免疫荧光检测在所述待测样品中检测IgG4、PLA2R、Nephrin和NPHS2中的一种或多种。所述免疫荧光检测按照以下步骤进行：(A)将免疫组合物作为一抗与所述生物样品接触，形成抗体-抗原复合物，洗涤除去未结合的一抗；(B)加入荧光标记的二抗进行染色，洗涤除去未结合的二抗；(C)制片，使用荧光显微镜观察荧光标记信号的位置及分布，其中，步骤(A)中的所述免疫组合物包括抗-IgG4抗体、抗-PLA2R抗体、抗-Nephrin抗体和抗-NPHS2抗体中的一种或多种。上述步骤(B)中的所述染色为单独染色、双重染色、三重染色或其任意组合。其中，所述单独染色包括对IgG4或PLA2R单独进行免疫荧光染色。其中，所述双重染色包括对以下任一组合中的两种物质均进行免疫荧光染色：组合(1)IgG4和PLA2R；组合(2)IgG4和Nephrin；或组合(3)IgG4和NPHS2。其中，所述三重染色包括对以下任一组合中的三种物质均进行免疫荧光染色：组合(4)IgG4、PLA2R和Nephrin；或组合(5)IgG4、PLA2R和NPHS2。步骤(2)中还可以通过免疫印迹检测在所述待测样品中检测IgG4、PLA2R、Nephrin和NPHS2中的一种或多种。所述免疫印迹检测包括在所述采集自受试者的生物样品中检测PLA2R的存在及其分子量。本专利技术提供的生物样品的检测方法具有如下有益效果：(1)该检测方法对尿液中的免疫标志物进行检测，得到关于免疫标志物存在、分布或含量的信息，利用免疫标志物的上述信息对膜性肾病进行初级筛查，为后期是否进行肾活检穿刺提供参考数据。当然，该方法并不直接获得受试者是否患有膜性肾病的诊断结果，免疫标志物的存在与否只是判断是否患有膜性肾病的一个中间结果，还需要进行后续或其他方法才能对膜性肾病进行确诊；当然，在结合或不结合其他因素的前提下，若临床医生认为本专利技术方法或用途的结果可信或者假设患者坚持以此方法为结论，也可直接进行治疗或留待观察。(2)该检测方法是非侵入性的，避免对受试者造成不必要的损伤，并且取样简便、检测快速简单、费用相对较低。(3)本专利技术提供的检测方法可以作为一种对特发性膜性肾病进行无创性检查的常规项目，为部分拒绝接受肾穿刺活检或有肾穿刺禁忌症的病人、或者无条件开展肾穿刺活检的医疗单位提供一种颇具指导意义的参考检测方法。附图说明图1示出根据本专利技术一种实施方式的待测样品的分离方法流程图。图2示出根据本专利技术一种实施方式的待测样品分离及检测方法流程图。图3示出根据本专利技术一种实施方式的膜性肾病患者的免疫荧光测试结果，其示出了IgG4与NPHS2的免疫荧光信号。图4示出根据本专利技术一种实施方式的膜性肾病患者的免疫荧光测试结果，其示出了PLA2R与Nephrin的免疫荧光信号。图5示出正常健康受试者的IgG4免疫荧光检测图像。图6-7示出膜性肾病患者的IgG4免疫荧光检测图像本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物样品的检测方法，包括以下步骤：(1)对采集自受试者的生物样品进行分离，得到待测样品；和(2)在所述待测样品中检测IgG4、PLA2R、Nephrin和NPHS2中的一种或多种，检测结果作为判断所述受试者是否需要进行肾活检的初步依据。

【技术特征摘要】
1.一种生物样品的检测方法，包括以下步骤：(1)对采集自受试者的生物样品进行分离，得到待测样品；和(2)在所述待测样品中检测IgG4、PLA2R、Nephrin和NPHS2中的一种或多种，检测结果作为判断所述受试者是否需要进行肾活检的初步依据。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品是尿液，所述待测样品是尿液经过离心处理得到的尿液沉淀物，所述待测样品包含以下中的一种或多种：细胞、细胞碎片、以及附着在所述细胞或所述细胞碎片上的免疫复合物。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，通过免疫荧光检测来在所述待测样品中检测所述IgG4、所述PLA2R、所述Nephrin和所述NPHS2中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述免疫荧光检测按照以下步骤进行：(A)将免疫组合物作为一抗与所述生物样品接触，形成抗体-抗原复合物，洗涤除去未结合的所述一抗；(B)加入荧光标记的二抗进行染色，洗涤除去未结合的所述二抗；(C)制片，使用荧光显微镜观察荧光标记信号的位置及分布，其中，所述步骤(A)中的所述免疫组合物包括抗-IgG4抗体、抗-PLA2R抗体、抗-Nep...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：祝胜郎，苏庆宁，
类型：发明
国别省市：广东,44