上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法及应用，益气活血方由黄芪提取物、生晒参提取物、赤芍提取和红花提取物组成。使用黄芪提取物、生晒参提取物A、生晒参提取物B、赤芍提取和红花提取物组成的益气活血方干预HUVECs细胞后发现药物可显著抑制由LPS诱导的PAI‑1、TF蛋白的表达，显著提高KLF2的表达，抑制LPS的作用；发现当敲低KLF2后，益气活血方失去其原有作用，说明益气活血方抗血栓因子表达具有KLF2依赖性。

【技术实现步骤摘要】
上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法及应用
本专利技术涉及中药组方。更具体地，涉及上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法及其应用。
技术介绍
血管内皮细胞是覆盖在血管内腔表面的连续单层扁平细胞，是处于血液与血管壁之间的一道天然屏障，正常生理条件下具有维持血管通透性、抗凝、抗炎等作用。而当大量细菌侵入体内，出现脓毒血症或并发症，血液中内毒素(lipopolysaccharide,LPS)浓度升高时，内皮细胞受到炎症刺激，功能发生紊乱，释放大量促凝血因子及细胞表面粘附因子，打破凝血平衡环境，激发凝血级联反应，与其他血管炎症相关因素形成血栓网络，极易诱发血栓的形成。纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogenactivatorinhibitor-1,PAI-1)和组织因子(tissuefactor,TF)是两个凝血反应启动因子，二者表达量的升高加剧血栓形成风险。体外研究表明，用LPS、TNFα等致炎因子刺激人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)后能够诱导PAI-1和TF的大量表达。Krüppel样因子家族(Kruppel-likefactor,KLFs)属于锌指蛋白的亚类，是一类具有DNA结合区的重要调控因子，参与多种基因的表达调控过程。目前鉴定出的KLFs家族成员有17种，其中KLF2是研究较多的一个，表达于多种细胞，调控机体多项生理、病理反应。KLF2血管内皮中具有较高表达，是重要的内皮功能调控因子，可调控多个血栓相关因子的表达，当过表达HUVECs中KLF2时，抑血栓因子内皮型一氧化氮合酶、血栓调节因子表达量上升，而促血栓因子PAI-1、TF表达量降低。目前已证实KLF2在炎症诱导血管内皮活化中有调控作用，在炎症因子刺激下，进而抑制KLF2的表达，导致下游促血栓因子PAI-1、TF表达量上升。过表达KLF2时，可以抑制炎性因子诱导的促血栓因子表达。因此，KLF2已成为研究药物抗炎、抗血栓作用的重要靶点。益气活血方(YiqiHuoxueDecoction)，是一个传统中药方，由黄芪、生晒参、赤芍和红花组成。黄芪是我国古老的补中益气的中药，近年来人们研究发现黄芪中含有黄芪多糖、黄芪皂苷、黄酮类成分，多种微量元素和以及多种氨基酸等；赤芍含有赤芍内脂苷、没食子酸乙酯、熊果苷、芍药醇、氧化芍药苷等多达20-30种化合物；红花中含有黄酮、生物碱、亚精胺、木质素、有机酸和多糖等多达50种以上化合物；生晒参中含有人参皂苷、人参多糖、聚乙炔醇类、木质素类、有机酸、生物碱等多达上百种化合物。可见黄芪、生晒参、赤芍、红花化学成分及其复杂，对机体的心血管、神经系统、免疫系统、抗肿瘤、抗炎镇痛等多种作用。然而传统中药大多集中于对于中药组方的研究，以及疗效的研究；随着科技的发展，逐渐转为中药中具体化学成份，以及作用机理的研究。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法及其应用。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，所述益气活血方由黄芪提取物、生晒参提取物、赤芍提取和红花提取物组成。上述上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，生晒参提取物由生晒参提取物A和生晒参提取物B组成，黄芪提取物、生晒参提取物A、生晒参提取物B、赤芍提取物和红花提取物的质量比为1：(2-4)：(0.5-1.5)：(1-3)：(5-7)。上述上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，所述黄芪提取物的制备方法为：(HQ-1)粉碎后的黄芪过60-80目筛；(HQ-2)加入四氢呋喃或液体四氢呋喃衍生物的水溶液，所加入的四氢呋喃或液体四氢呋喃衍生物的水溶液的质量是黄芪质量的8-10倍，所述四氢呋喃或液体四氢呋喃衍生物与水的体积比为(0.5-1)：1，回流提取2-3次，每次提取30-60min；(HQ-3)合并提取液，减压浓缩至20-25℃时相对密度为0.85-1.25；(HQ-4)然后调节pH值到6.8-7.2，使用X-5大孔树脂对提取液进行吸附，然后用乙醇的水溶液进行洗脱，V乙醇：V水＝(4-5)：1，采用减压蒸馏除去溶剂，30-60℃干燥，所得固体即为黄芪提取物。上述上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，所述生晒参提取物A和生晒参提取物B的制备方法，包括如下步骤：(SSS-1)生晒参粉碎后，过50-80目筛；(SSS-2)加入丙氧基丙烷和水进行回流，所加入的丙氧基丙烷和水的总质量是生晒参质量的5-6倍，回流提取2-3次，每次提取1-1.5h，合并提取液；所述丙氧基丙烷与水的体积比为(0.5-1.5)：1；(SSS-3)提取液静置20-30min分层，得到有机相和无机相；(SSS-4)无机相减压蒸馏除去溶剂后，采用微波干燥法干燥，微波的频率为300-500MHz，所得固体即为生晒参提取物A；(SSS-5)有机相先用无水氯化钙干燥除水，再采用减压浓缩，然后采用微波干燥法干燥，微波的频率为300-500MHz，所得固体即为生晒参提取物B。上述上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，所述赤芍提取物的制备方法，包括如下步骤：(CS-1)赤芍粉碎后，过80-100目筛；(CS-2)加入噻唑、酯和乙醇的混合溶液进行回流，所加入噻唑、酯和乙醇的混合溶液的质量为赤芍质量的8-9倍；回流提取2-3次，每次回流1-2h，合并提取液；所述酯、乙醇和噻唑的体积比为(1-2):1：(0.1-0.5)。(CS-3)减压浓缩提取液至20-25℃时相对密度为0.85-1.25，然后采用微波干燥法干燥，微波的频率为500-600MHz，所得固体即为赤芍提取物。上述上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，所述酯为乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯或甲酸甲酯的一种或多种。上述上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，所述红花提取物的制备方法，包括如下步骤：(HH-1)红花粉碎后，过100-200目筛；(HH-2)加入3-环己基丙酸烯丙酯和二乙基硫醚的混合液，所加入3-环己基丙酸烯丙酯和二乙基硫醚的混合液的质量为红花质量的9-10倍；回流提取2-3次，每次回流1-1.5h，合并提取液；所述3-环己基丙酸烯丙酯和二乙基硫醚的体积比为(0.5-1)：1；(HH-3)减压浓缩提取液至20-25℃时相对密度为0.85-1.25，然后采用微波干燥法干燥，微波的频率为300-400MHz，所得固体即为红花提取物。上述制备的益气活血方在上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达中的应用，(1)益气活血方预处理生长良好的人脐静脉内皮细胞系HUVECs；(2)加入脂多糖LPS刺激，收集细胞；(3)用Westernblot检测法，检测KLF2的表达量，抑制LPS诱导HUVECs细胞促血栓因子表达。上述制备的益气活本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，其特征在于,所述益气活血方由黄芪提取物、生晒参提取物、赤芍提取和红花提取物组成。

【技术特征摘要】
1.上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，其特征在于,所述益气活血方由黄芪提取物、生晒参提取物、赤芍提取和红花提取物组成。2.根据权利要求1所述的上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，其特征在于，生晒参提取物由生晒参提取物A和生晒参提取物B组成，黄芪提取物、生晒参提取物A、生晒参提取物B、赤芍提取物和红花提取物的质量比为1：(2-4)：(0.5-1.5)：(1-3)：(5-7)。3.根据权利要求2所述的上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，其特征在于，所述黄芪提取物的制备方法为：(HQ-1)粉碎后的黄芪过60-80目筛；(HQ-2)加入四氢呋喃或液体四氢呋喃衍生物的水溶液，所加入的四氢呋喃或液体四氢呋喃衍生物的水溶液的质量是黄芪质量的8-10倍，所述四氢呋喃或液体四氢呋喃衍生物与水的体积比为(0.5-1)：1，回流提取2-3次，每次提取30-60min；(HQ-3)合并提取液，减压浓缩至20-25℃时相对密度为0.85-1.25；(HQ-4)然后调节pH值到6.8-7.2，使用X-5大孔树脂对提取液进行吸附，然后用乙醇的水溶液进行洗脱，V乙醇：V水＝(4-5)：1，采用减压蒸馏除去溶剂，30-60℃干燥，所得固体即为黄芪提取物。4.根据权利要求2所述的上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，其特征在于，所述生晒参提取物A和生晒参提取物B的制备方法，包括如下步骤：(SSS-1)生晒参粉碎后，过50-80目筛；(SSS-2)加入丙氧基丙烷和水进行回流，所加入的丙氧基丙烷和水的总质量是生晒参质量的5-6倍，回流提取2-3次，每次提取1-1.5h，合并提取液；所述丙氧基丙烷与水的体积比为(0.5-1.5)：1；(SSS-3)提取液静置20-30min分层，得到有机相和无机相；(SSS-4)无机相减压蒸馏除去溶剂后，采用微波干燥法干燥，微波的频率为300-500MHz，所得固体即为生晒参提取物A；(SSS-5)有机相先用无水氯化钙干燥除水，再采用减压浓缩，然后采用微波干燥法干燥，微波的频率为300-500MHz，所得固体即为生晒参提取物B。5.根据权利要求2所述的上调KLF2表达抗LPS诱导HUVECs促血栓因子表达益气活血方的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴鸿，高水波，王新洲，尹悦，雷震，高海霞，韩勇军，王振涛，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：河南,41