一种模拟双烯雌酚的抗原表位肽、其制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种模拟双烯雌酚的抗原表位肽、其制备方法及应用。该技术方案首先基于噬菌体展示肽库技术，以抗DIS单克隆抗体为靶标，从噬菌体随机展示七肽库中淘选得一种序列为CTLNWAC的DIS抗原模拟表位。本发明专利技术分别给出了通过噬菌体扩增手段、通过基因重组手段制备该抗原模拟表位的方法。本发明专利技术围绕该抗原模拟表位的免疫结合特性，基于酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、荧光微球免疫层析法设计了具体的检测方法。该抗原模拟表位具有与天然DIS分子相似的免疫反应特性，可以替代价格昂贵且具有致畸、致癌作用的DIS标准品用于DIS的免疫学检测，检测结果准确、灵敏度高。

Antigen epitope peptide for simulating diethylstilbestrol, preparation method and application thereof

The invention provides an antigenic epitope peptide for simulating diethylstilbestrol, its preparation method and application. Based on the phage display peptide library technology, a DIS antigen mimic epitope of CTLNWAC sequence was selected from the seven peptide library of the phage random display seven peptide library, based on the phage display peptide library technology. The present invention provides a method for preparing the antigen mimic epitope by means of phage amplification and gene recombination. The present invention has designed specific detection methods based on the immune binding characteristics of the antigen mimic epitopes, based on the enzyme linked immunosorbent assay, colloidal gold immunochromatography and fluorescent microsphere immunochromatography. The antigen mimic epitope has the characteristic of immune response similar to the natural DIS molecule. It can replace the expensive and teratogenic and carcinogenic DIS standard used for the immunological detection of DIS. The test results are accurate and high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种模拟双烯雌酚的抗原表位肽、其制备方法及应用
本专利技术涉及噬菌体展示肽库
，具体涉及一种模拟双烯雌酚的抗原表位肽、其制备方法及应用。
技术介绍
双烯雌酚(Dienestrol，DIS)是人工合成的非甾体雌激素，也是典型违禁兽药己烯雌酚在动物体内的主要代谢产物之一，由于在促进蛋白沉积、提高动物日增重和减少脂肪合成等方面作用明显，曾作为促生长剂广泛应用于畜牧养殖业。研究表明过量使用DIS会导致其动物组织中高度残留，通过食物链直接会对人体产生致畸、致癌等危害。虽然我国已经规定畜牧养殖业中禁止使用DIS，但由于受到利益驱使，违法使用依然存在。因此，对食品中DIS残留进行及时检测不仅是预防和控制DIS危害的有效手段，也是间接监控己烯雌酚危害的有效手段。目前，食品中DIS的检测方法主要有高效液相色谱、气相色谱、高效液相色谱串联质谱、气相色谱串联质谱和免疫分析等方法，免疫分析方法以其简单方便、灵敏度高、成本较低等特性在DIS的检测中得到了广泛的应用。但是，在实施免疫分析检测的过程中，必须使用DIS标准品为基础原材料来制备竞争抗原或者固相包被抗原，DIS不仅价格昂贵且致畸致癌性强，微量就能对人体的内分泌系统、生殖系统、免疫系统造成伤害，如操作不当就会直接对检测人员的身体健康和生态环境造成极大的危害。近年来研究人员采用抗原模拟表位成功替代小分子抗原进行了免疫学检测，在这种情况下，如果能获取一种与天然DIS具有相似免疫反应特性的替代性无毒物质，则有望在针对DIS的免疫检测方法中避免使用大量的DIS标准品，以期降低检测成本同时提升安全性。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种模拟双烯雌酚的抗原表位肽，以解决现有技术中缺乏一种与双烯雌酚具有相似免疫反应特性、能替代其作敏感型免疫检检测元件的技术问题。本专利技术同时提供了上述模拟双烯雌酚的抗原表位肽的制备方法，以解决其制备方法不明确的技术问题。本专利技术同时提供了上述模拟双烯雌酚的抗原表位肽在具体免疫检测方法中的应用，以解决现有技术中的常规检测方法未针对该抗原表位肽的免疫学性质进行适应性匹配，因而难以获得最佳检测效果的技术问题。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种模拟双烯雌酚的抗原表位肽，其氨基酸序列为：CTLNWAC。一种编码上述抗原表位肽的基因，其核苷酸序列为：TGTACTCTTAATTGGGCGTGT。本专利技术同时提供了上述抗原表位肽的一种制备方法，包括以下步骤：将具有DIS抗原模拟表位的噬菌体加入至20ml接种有ER2738大肠杆菌的培养液中，37℃150rpm振荡培养4.5h；将培养物转入另一离心管中，4℃12000g离心10min，将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃静置过夜；4℃12000g离心15min，沉淀重悬于1mlTBS中，4℃14000rpm离心5min；上清转入另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育1h，4℃14000rpm离心10min；弃上清，沉淀重悬于200μlTBS中。在该制备方法中，所述具有DIS抗原模拟表位的噬菌体，可以是通过以下淘选方法获得的：DIS抗原模拟表位的亲和淘选：具体方法为：用0.1MNaHCO3(pH8.6)稀释抗DIS单克隆抗体，并以终浓度80μg/ml加入96孔酶标单孔中，4℃包被过夜。次日用TBST[50mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl，0.1％Tween-20(v/v)]快速洗涤6次后，加入350μl1％OVA封闭液，4℃封闭2h。弃封闭液，用TBST洗涤6次，加入120μl噬菌体肽库(噬菌体展示七肽库，购自NEB公司，用TBST稀释噬菌体，加入量为2.0×1011pfu)，25℃反应50min。弃孔中的噬菌体，用TBST快速洗涤10次，拍干，用0.2MGlycine-HCl(pH2.2)洗脱，然后用15μl1MTris-HCl(pH9.1)中和洗脱液。取5μl洗脱噬菌体测滴度，剩余的用于E.coliER2738菌株进行扩增。次日用PEG/NaCl纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。在第二、第三轮的淘选过程中，包被的抗DIS单克隆抗体浓度分别为40μg/ml和20μg/ml，封闭液依次为1％BSA和1％OVA，所用的TBST浓度为0.3％和0.5％。洗脱方式中，第二轮依然采用0.2MGlycine-HCl(pH2.2)洗脱，第三轮为DIS标准品(100ng/ml)竞争洗脱，其余步骤同上。本专利技术同时提供了上述抗原表位肽的另一种制备方法，包括以下步骤：1)PCR扩增序列为TGTACTCTTAATTGGGCGTGT的DNA片段，分别采用ACC65I和EagI酶对该DNA片段和pMAl-pIII表达载体进行双酶切；将质粒pMal-PIII和该DNA片段以1∶10的摩尔比混匀，于16℃水浴连接12h，取10μl连接产物加至100μl感受态细胞TB1中，充分混匀；冰浴30min后，42℃水浴热激90s，立即冰浴5min后补加600μlLB液体培养液，37℃200rpm培养1h，10000rpm离心1min，吸去上清留取约200μl，涂布于LB-A固体培养基中，37℃过夜培养，得到阳性克隆。2)将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5mlLB-A、0.2％蔗糖中，37℃220rpm振荡培养过夜，将过夜培养物按1％(v/v)的接种量接种于50ml的LB-A、0.2％蔗糖培养基中，37℃220rpm振荡培养，当培养物细菌浓度达到OD600nm值为0.6时，向培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mM，220rpm振荡培养，将PEG溶液于4℃4000g离心20min，收集菌体沉淀，弃上清；重悬细胞于400ml含有30mMTris-HCl、20％蔗糖且pH为8.0的溶液中，加入EDTA至1mM，室温下震荡10min，4℃8000g离心20min，弃上清，沉淀重悬于400ml预冷的5mMMgSO4，冰上震荡10min，4℃8000g离心20min，保留上清，向上清液中加入8mlpH为7.4、浓度为1M的Tris-HCl，获得DIS抗原模拟表位-MBP融合蛋白。此外，上述抗原表位肽还可以是基于其氨基酸序列通过多肽化学合成的方法获得的。本专利技术还提供了上述抗原表位肽作为酶联免疫吸附法的竞争抗原用于检测食品中双烯雌酚的应用。本专利技术还提供了上述抗原表位肽作为酶联免疫吸附法的固相抗原用于检测食品中双烯雌酚的应用。本专利技术还提供了上述抗原表位肽作为胶体金试纸的检测线用于检测食品中双烯雌酚的应用。作为优选，该应用包括以下步骤：用10mMPBS缓冲液稀释具有DIS抗原模拟表位的噬菌体至2.0×1011pfu，取0.5mg/ml的羊抗鼠IgG二抗，用XYZ三维点喷仪分别喷点于硝酸纤维素膜上，作为试纸条的检测线和质控线，两线间隔约为7mm，37℃干燥12h，备用。用K2CO3调1ml胶体金溶液至pH值为8.0，用蒸馏水稀释抗DIS单克隆抗体至0.05mg/ml，取适量缓慢加入胶体金溶液中，边滴边搅拌，搅拌反应1h后，加入100μl1％PEG至溶液中，继续搅拌30min；加入100μl10％BSA溶液，搅拌30min，4℃8000rpm离心30m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种模拟DIS的抗原表位肽，其氨基酸序列为：CTLNWAC。

【技术特征摘要】
1.一种模拟DIS的抗原表位肽，其氨基酸序列为：CTLNWAC。2.一种编码权利要求1所述抗原表位肽的基因，其核苷酸序列为：TGTACTCTTAATTGGGCGTGT。3.权利要求1所述抗原表位肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将具有DIS抗原模拟表位的噬菌体加入至20ml接种有ER2738大肠杆菌的培养液中，37℃150rpm振荡培养4.5h；将培养物转入另一离心管中，4℃12000g离心10min，将上清上部80％体积的部分转入另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃静置过夜；4℃12000g离心15min，沉淀重悬于1mlTBS中，4℃14000rpm离心5min；上清转入另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育1h，4℃14000rpm离心10min；弃上清，沉淀重悬于200μlTBS中。4.权利要求1所述抗原表位肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)PCR扩增序列为TGTACTCTTAATTGGGCGTGT的DNA片段，分别采用ACC65I和EagI酶对该DNA片段和pMAl-pIII表达载体进行双酶切；将质粒pMal-PIII和该DNA片段以1:10的摩尔比混匀，于16℃水浴连接12h，取10μl连接产物加至100μl感受态细胞TB1中，充分混匀；冰浴30min后，42℃水浴热激90s，立即冰浴5min后补加600μlLB液体培养液，37℃200rpm培养1h，10000rpm离心1min，吸去上清留取约200μl，涂布于LB-A固体培养基中，37℃过夜培养，得到阳性克隆。2)将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5mlLB-A、0.2％蔗糖中，37℃220rpm振荡培养过夜，将过夜培养物按1％(v/v)的接种量接种于50ml的LB-A、0.2％蔗糖培养基中，37℃220rpm振荡培养，当培养物细菌浓度达到OD600nm值为0.6时，向培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mM，220rpm振荡培养，将PEG溶液于4℃4000g离心20min收集菌体沉淀，弃上清；重悬细胞于400ml含有30mMTris-HCl、20％蔗糖且pH为8.0的溶液中，加入EDTA至1mM，室温下震荡10min，8000g4℃离心20min，弃上清，沉淀重悬于400ml预冷的5mMMgSO4，冰上震荡10min，4℃8000g离心20min，保留上清，向上清液中加入8mlpH为7.4、浓度为1M的Tris-HCl，获得DIS抗原模拟表位...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓省亮，李平，贺伟华，涂祖新，张莉莉，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：江西,36