本发明专利技术公开了提高砷胁迫水稻耐受性的microRNA基因及其应用，主要涉及植物功能基因组学领域。包括提高水稻对砷胁迫耐受性的微小RNA即osa‑miR812q，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该microRNA的前体基因在水稻中过量表达后，转基因株系在砷胁迫下的耐受能力明显高于野生型水稻。本发明专利技术的有益效果在于：在水稻体内过表达本发明专利技术的microRNA，能够显著提高水稻对砷胁迫的耐受性，缓解砷对水稻的毒害，降低砷在水稻中的积累，对提高水稻品质具有重大的意义，为培育耐受砷胁迫的水稻新品种提供了新的基因资源。
MicroRNA gene for improving rice tolerance under arsenic stress and its application
The invention discloses a microRNA gene for improving arsenic stress tolerance of rice and its application, mainly relating to the field of plant functional genomics. It includes RNA, OSA miR812q, which can enhance the tolerance to arsenic stress in rice. Its nucleotide sequence is SEQ ID NO.1. When the precursor gene of the microRNA was overexpressed in rice, the tolerance of transgenic rice lines to arsenic stress was significantly higher than that of wild type rice. The beneficial effect of the invention is that overexpression of the microRNA in rice can significantly improve the tolerance of rice to arsenic stress, alleviate the toxicity of arsenic to rice, reduce the accumulation of arsenic in rice, and is of great significance for improving the quality of rice, and provides a new basis for the cultivation of new rice varieties tolerant to arsenic stress. Because of the resources.
【技术实现步骤摘要】
提高砷胁迫水稻耐受性的microRNA基因及其应用
本专利技术涉及植物功能基因组学领域，具体是提高砷胁迫水稻耐受性的microRNA基因及其应用。
技术介绍
砷(Arsonism,As)是表土污染五大有害元素之一。近年来，采矿冶炼和含砷除草剂的使用加剧了土壤中砷的污染程度，中国土壤砷污染形势已相当严峻。砷不仅影响土壤生态结构和功能，而且能抑制作物的生长发育，降低产量和品质。砷可通过食物链进入人体，作用于半胱氨酸残基导致酶和蛋白质构象畸变，并阻止二硫键生成，对人体具有强烈毒害作用，被列为I级致癌物。水稻(Oryzasativa)对砷的吸收和积累能力远高于其他谷类作物，在缺氧的水稻土壤中，砷的主要存在形式为三价亚砷酸盐As(III)，其毒性比五价砷酸盐As(V)更强，水稻砷污染已成为人类砷暴露危害的主要途径之一。中国是世界水稻种植和消费第一大国，因此，提出避免水稻砷伤害的有效措施和提高砷胁迫下的抗性的有效方法，将对保障农作物生态安全和人民健康、促进农业可持续发展具有重要意义。microRNA(miRNA)是一种内源性非编码小分子RNA，通过序列配对调控转录后或翻译水平的靶基因表达，从而调控植物生长发育、激素分泌、信号转导、器官形态建成等过程。microRNA作为细胞逆境应答的激活因子，在重金属、干旱和高温等环境胁迫应答中发挥着重要作用。近年来，随着高通量芯片和测序技术的广泛运用，miRNA的大规模高通量鉴定得以实现，重金属逆境应答相关miRNA的发掘取得了一定进展。Ding等人(Y.Ding,Z.ChenandC.Zhu,Microarray-basedanalysisofcadmium-responsivemicroRNAsinrice(Oryzasativa),J.Exp.Bot.,2011,62,3563–3573)利用miRNA微阵列芯片和荧光定量PCR技术从水稻中筛选到了19个与镉胁迫应答相关的miRNA。Yu等人(L.J.Yu,Y.F.Luo,B.Liao,L.J.Xie,L.Chen,S.Xiao,J.T.Li,S.N.HuandW.S.Shu,Comparativetranscriptomeanalysisoftransporters,phytohormoneandlipidmetabolismpathwaysinresponsetoarsenicstressinrice(Oryzasativa),NewPhytol.,2012,195,97–112.)利用高通量测序鉴定获得36个砷胁迫下差异表达的水稻miRNA。因此，利用miRNA的遗传操作改良作物对重金属胁迫的耐性已成为一个可行的技术手段。miR812是一种广泛存在于单子叶植物和双子叶植物中的miRNA。miR812可靶向CIPK10，CIPK10进一步和CBL相互作用从而激活CBL-CIPK信号转导通路，该通路在调节逆境胁迫耐受性中具有重要作用。已有研究报道miR812在植物对环境胁迫的应答过程中发挥着一定作用。Kansal等人(KansalS,MutumRD,DeviRM,etal.UniquemiRNomeduringanthesisindrought-tolerantindicaricevar.Nagina22.[J].Planta,2015,241(6):1-1.)对比了干旱胁迫下粳稻品种Nagina22抽穗至开花期的microRNA表达谱，发现水稻miR812在干旱胁迫下差异表达，可能对干旱和高温胁迫具有敏感性。然而，目前尚未见到关于miR812在重金属胁迫下调控功能的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种microRNA基因以及其在在提高水稻砷胁迫耐受性方面的应用。通过在水稻种过表达前述基因，培育耐受砷胁迫的水稻新品种。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种提高水稻对砷胁迫耐受性的微小RNA即osa-miR812q，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述microRNA的前体序列为序列表中的SEQIDNO.2。所述microRNA前体序列的编码序列为序列表中的SEQIDNO.3。此编码序列被导入水稻细胞后可被水稻细胞转录成前体microRNA，所述的前体microRNA可被剪切并加工为成熟的microRNA，进而影响到相关生物学功能的发挥；此osa-miR812q前体序列的基因定位在水稻10号染色体上，实时荧光定量PCR检测结果表明，osa-miR812q在亚砷酸钠胁迫后发育过程中受到显著诱导。包含上述编码序列的重组表达载体，为在pCAMBIA1301空载体的限制性内切酶位点PstI和KpnI之间插microRNA前体序列的基因，得到重组表达载体。如序列表SEQIDNO.1所示的microRNA基因在提高水稻砷胁迫耐受性中的应用。培出具有砷胁迫耐受性的转基因水稻。其方法优选为通过PCR方法扩增miR812q的前体基因，构建含有miR812q前体基因的重组表达载体并将载体导入农杆菌，通过农杆菌侵染水稻愈伤组织，筛选获得具有砷胁迫耐受性的水稻植株。对比现有技术，本专利技术的有益效果在于：在水稻体内过表达本专利技术的microRNA，能够显著提高水稻对砷胁迫的耐受性，缓解砷对水稻的毒害，降低砷在水稻中的积累，对提高水稻品质具有重大的意义，为培育耐受砷胁迫的水稻新品种提供了新的基因资源。附图说明附图1为osa-miR812q前体基因的PCR扩增凝胶图谱；附图2为35S:miR812q重组质粒菌液PCR扩增凝胶图谱；附图3为35S:miR812q重组质粒酶切鉴定图；附图4为35S:MIR812q过表达载体T-DNA区的结构图；附图5为三叶期水稻在10mMNaAsO2处理7天后表型(WT为野生型；35S:MIR812q为转基因水稻)；图6为砷胁迫7天后水稻叶绿素含量的变化情况；图7为砷胁迫7天后水稻地上部和根中的砷含量。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。实施例1：osa-miR812q前体基因的克隆用于基因克隆与表达的水稻品种为苏香粳3号(OryzasativaL.subsp.Japonica，cv.Suxiang3)。克隆的osa-miR812q前体序列如序列表SEQIDNO.2；前体序列表达的成熟序列如SEQIDNO.1所示。挑选饱满的水稻种子，70％乙醇消毒，蒸馏水冲洗后转移至湿滤纸，5％霍格兰营养液催芽2天。露白后转移至光温培养箱(16h光照/8h黑暗，温度25℃，相对湿度70％)，每3天更换1次营养液。将18天龄幼苗用10mMNaAsO2进行胁迫处理，未处理组作为对照，每组3次重复。处理48h后对叶片取样，液氮冷冻并-80℃储存。使用Trizol法分别提取对照组和NaAsO2胁迫组总R本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.提高砷胁迫水稻耐受性的microRNA基因，其特征在于：其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1。
【技术特征摘要】
1.提高砷胁迫水稻耐受性的microRNA基因，其特征在于：其核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO.1。2.根据权利要求1所述的提高砷胁迫水稻耐受性的microRNA基因，其特征在于：所述microRNA的前体序列为序列表中的SEQIDNO.2。3.根据权利要求1所述的提高砷胁迫水稻耐受性的microRNA基因，其特征在于：所述microRNA前体序列的编码序列为序列表中的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈佳佳，李良智，陈宏伟，扶教龙，胡翠英，
申请(专利权)人：苏州科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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