一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔CaCO3纳米粒子的方法技术

本发明专利技术公开了一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔CaCO3纳米粒子的方法，具体包括如下步骤：(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白：①确定重组胶原蛋白的序列；②合成编码重组胶原蛋白的核酸；③重组胶原蛋白的制备与纯化；(2)微孔CaCO3纳米材料的制备：①重组胶原蛋白与碳酸钠和氯化钙均匀混合溶液的配制；②将混合溶液放在25℃恒温箱中制备微孔CaCO3纳米粒子；③纯化并干燥保存制备的纳米材料。本发明专利技术采用重组胶原蛋白作为生物模板，碳酸钠和氯化钙作为原料，在室温下制备了大小和形貌可控的微孔CaCO3纳米材料。本发明专利技术简单方便，易于操作，制备的微孔CaCO3有较高的负载效率和可持续的药物释放性能，有希望作为安全递送药物的载体。

Preparation of microporous CaCO3 nanoparticles using recombinant collagen as biomineralization template

The invention discloses a method for preparing microporous CaCO3 nanoparticles with recombinant collagen as a biomineralization template, which includes the following steps: (1) the recombinant collagen is prepared by biological gene engineering technology: (1) the sequence of recombinant collagen is determined; (2) the nucleic acid of the recombinant collagen is synthesized; and the recombinant collagen is reorganized. Preparation and purification; (2) preparation of microporous CaCO3 nanomaterials: (1) preparation of recombinant collagen with homogeneous mixture of sodium carbonate and calcium chloride; (2) preparing microporous CaCO3 nanoparticles in a constant temperature box of 25 C; (3) the preparation of nanoscale materials by purification and drying. The present invention uses recombinant collagen as a biological template, sodium carbonate and calcium chloride as raw materials, and prepared microporous CaCO3 nanomaterials with controllable size and morphology at room temperature. The invention is simple, convenient and easy to operate, and the prepared microporous CaCO3 has high load efficiency and sustainable drug release performance, and it is hopeful to be the carrier of safe delivery drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔CaCO3纳米粒子的方法
本专利技术属于生物无机材料制备
，具体涉及一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔CaCO3纳米粒子的方法。
技术介绍
碳酸钙是自然界中发现的最丰富的无机材料之一。由于纳米级碳酸钙材料具有生物相容性，生物降解性和无毒性等巨大性能，因此已经在工业和生物
中被合成用于各种应用。例如，基因和药物输送，骨修复和组织工程。碳酸钙纳米粒子的高孔隙率，表面积和低质量传输限制使其对于设计许多可靠且成本低廉的生物传感器具有吸引力。生物矿化，是生物在特定的部位和一定的物理化学条件下，在生物有机物质的调控下，将溶液中的离子转变为固相矿物的过程。不同于一般的矿化作用，生物矿化通过生物大分子从分子水平上控制无机矿物相的结晶、生长，从而使生物矿物具有特殊的分级结构和组装方式。近年来研究表明，生物体对生物矿化过程的控制是一个复杂的多层次过程，受到生物有机质、晶体自身生长机制、以及外界环境等各方面的综合调控作用。胶原蛋白具有良好的生物相容性、生物降解性、吸收性以及促进细胞形成等诸多功能，因此在生物医用材料、组织工程、化妆品、食品等领域广泛应用。以胶原蛋白为生物模板合成的骨骼、牙齿代表了自然界一种最经典的生物矿化现象。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔CaCO3纳米粒子的方法，采用重组胶原蛋白作为生物模板，碳酸钠、氯化钙作为原料，在温和条件下制备大小和形貌可控的微孔CaCO3纳米材料。为实现上述目的，本专利技术公开了如下技术方案：一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔CaCO3纳米粒子的方法，包括如下步骤：(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白①确定重组胶原蛋白的序列：重组胶原蛋白的序列为：GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP，该重组胶原蛋白具备良好的三重螺旋结构，热变温度接近37℃；②合成编码重组胶原蛋白的核酸：合成编码步骤①重组胶原蛋白的核酸，构建导入上述核酸的质粒，并将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；③重组胶原蛋白的制备与纯化。(2)微孔CaCO3纳米材料的制备①重组胶原蛋白与碳酸钠和氯化钙均匀混合溶液的配制：在NaCO3的水溶液中加入0-120mg重组胶原蛋白粉末，混合均匀，再向该溶液中缓慢滴加氯化钙溶液溶液；剧烈搅拌5-120min后，得到白色的絮状物；②温和的生物矿化条件下制备纳米级微孔CaCO3：将所得絮状混合物放在20-37℃的恒温箱中，放置1-10天，得到白色沉淀；③纯化并干燥保存制备的纳米材料：将产物通过离心分离，离心条件为12000rpm，弃去上清液，留下固体；并用去离子水分散固体，再离心纯化3-5次，在20-37℃恒温干燥箱中干燥即得。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤(2)中所述的胶原蛋白粉末加入量为0.1-120mg，胶原蛋白质量分数为0.01-6wt％。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤(2)中所述的碳酸钠固体加入量为10-80mM，。作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤(2)中第②步中所述的絮状混合物在25℃的恒温箱中放置2天。本专利技术的有益效果在于：①本研究采用重组胶原蛋白作为生物模板，氯化钙作为原料，在温和条件下制备大小和形貌可控的微孔CaCO3纳米材料。②本专利技术在整个合成过程中无需进行后处理，简单方便，易于操作，具有很大的应用前景，可为规模化生产微孔CaCO3纳米材料提供基础。③由重组胶原蛋白作为生物模板调控CaCO3纳米晶型，得到特定形貌的CaCO3纳米粒子，有较高的负载效率和可持续的药物释放性能。附图说明图1为实施例1制备的微孔CaCO3纳米材料的粉末X射线多晶衍射(XRD)图(a)和X射线光电子能谱(XPS)图(b)；图2为实施例1制备的微孔CaCO3纳米材料的热重分析(TGA)图；图3为实施例1制备的微孔CaCO3纳米材料的红外分析(FT-IR)图；图4为实施例1制备的微孔CaCO3纳米材料的分析图；图5为不同放置时间的实施例1制备的CaCO3纳米颗粒形貌透射电子显微镜图(TEM)和扫描电子显微镜图(SEM)；具体实施方式下面将结合说明书附图对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分，而不是专利技术的全部。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备得到微孔CaCO3纳米粒子及其表征一种以胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔CaCO3纳米粒子的方法，包括如下步骤：(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白①确定重组胶原蛋白的序列：重组胶原蛋白的序列为：GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRGEQGPQGLPGKDGEAGAQGRPGKRGKQGQKGEKGEPGTQGAKGDRGETGPVGPRGERGEAGPAGKDGERGFPGERGVEGQNGQDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQNGKDGLPGKDGKDGQDGKDGLPGKDGKDGLPGKDGKDGQPGKPGKYGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPPGPP，该重组胶原蛋白具备良好的三重螺旋结构，热变温度接近37℃；②合成编码重组胶原蛋白的核酸：合成编码步骤①重组胶原蛋白的核酸，构建导入上述核酸的质粒，并将质粒转化大肠杆菌BL21-DE3菌株；③重组胶原蛋白的制备与纯化：取50μL菌液加到100mL含抗生素的LB液体培养基中，恒温摇床过夜进行增菌培养后，转移到1L含抗生素的LB培养基中，在37℃恒温摇床中继续扩增培养；待OD600值达到0.8-1范围，将摇床温度调为25℃，加入1mMIPTG诱导表达，恒温过夜培养；将菌液在低温离心机中离心，收集菌体；将菌体用A缓冲液溶解，A缓冲液为20mM咪唑，20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，pH为7.4；利用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，超声时细菌悬浊液放于冰浴中，以防温度过高导致蛋白变性；将破碎完的悬浊液再次离心，使细胞碎片与蛋白溶液分离，离心条件：14000rpm,4℃，30-50min；收集上清液，即粗蛋白溶液，通过液相色谱进行进一步纯化；后经冻干，得到白色絮状固体；此固体放于-20℃冰箱保存，使用时通过称重法标定浓度；(2)CaCO3纳米材料的制备①重组胶原蛋白与碳酸钠和氯化钙均匀混合溶液的配制：在NaCO3浓度为0.05mol/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔CaCO3纳米粒子的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白(2)微孔CaCO3纳米材料的制备①重组胶原蛋白与碳酸钠和氯化钙均匀混合溶液的配制：在NaCO3的水溶液中加入0‑120mg重组胶原蛋白粉末，混合均匀，再向该溶液中缓慢滴加氯化钙溶液溶液；快速搅拌5‑120min后，得到白色的絮状物；②温和的生物矿化条件下制备纳米级微孔CaCO3：将所得絮状混合物放在20‑37℃的恒温箱中，放置1‑10天，得到白色沉淀；③纯化并干燥保存制备的纳米材料：将产物通过离心分离，离心条件为12000rpm，弃去上清液，留下固体；并用去离子水分散固体，再离心纯化3‑5次，在20‑37℃恒温干燥箱中干燥即得。

【技术特征摘要】
1.一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔CaCO3纳米粒子的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：(1)利用生物基因工程技术制备重组胶原蛋白(2)微孔CaCO3纳米材料的制备①重组胶原蛋白与碳酸钠和氯化钙均匀混合溶液的配制：在NaCO3的水溶液中加入0-120mg重组胶原蛋白粉末，混合均匀，再向该溶液中缓慢滴加氯化钙溶液溶液；快速搅拌5-120min后，得到白色的絮状物；②温和的生物矿化条件下制备纳米级微孔CaCO3：将所得絮状混合物放在20-37℃的恒温箱中，放置1-10天，得到白色沉淀；③纯化并干燥保存制备的纳米材料：将产物通过离心分离，离心条件为12000rpm，弃去上清液，留下固体；并用去离子水分散固体，再离心纯化3-5次，在20-37℃恒温干燥箱中干燥即得。2.根据权利要求1所述的一种以重组胶原蛋白为生物矿化模板制备微孔CaCO3纳米粒子的方法，其特征在于:所述的步骤(1)中重组胶原蛋白由以下步骤制备：①确定重组胶原蛋白的序列：重组胶原蛋白的序列为：GSPGLPGPRGEQGPTGPTGPAGPRGLQGLQGLQGERGEQGPTGPAGPRGLQGERGEQGPTGLAGKAGEAGAKGETGPAGPQGPRG...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建喜，何会霞，付彩虹，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62