磷灰石的表面中和制造技术

本文公开了在例如色谱期间和蛋白质洗脱之前中和磷灰石表面的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】磷灰石的表面中和相关申请的交叉引用本申请要求2015年10月28日提交的美国临时专利申请62/247,330的优先权，将其全部内容通过引用纳入本文。背景羟基磷灰石和氟磷灰石以及其他磷灰石固体载体用于纯化多种生物分子，包括蛋白质，碳水化合物，多核苷酸和病毒颗粒。
技术实现思路
本文公开了纯化样品中的目标分子的方法。在一些实施方式中，该方法包括：(a)用适于在磷灰石固体表面上吸附目标分子的缓冲剂组合物平衡磷灰石固体表面，然后使包含目标分子的样品与磷灰石固体表面接触，由此将目标分子吸附到固体表面；(b)在步骤(a)之后，使包含吸附的目标分子的固体表面与包含以下物质的溶液接触：(i)碱性氨基化合物和阳离子胺；(ii)磺化胺化合物和阳离子胺；或(iii)磷酸盐和阳离子胺，其中阳离子胺具有足够的体积和浓度以从磷灰石固体表面置换水合氢离子，并且步骤(b)中的缓冲液具有足够的体积和浓度以中和置换的水合氢离子，其中所述溶液具有足够低的离子强度使得目标分子保持吸附于固体载体，并且其中步骤(a)中的缓冲剂组合物与步骤(b)中的溶液有不同的组成；并且(c)在步骤(b)之后，通过使固体载体和与步骤(b)中的溶液有不同组成的溶液接触，从中和的固体载体上洗脱目标分子，由此纯化样品中的目标分子。在一些实施方式中，阳离子胺是铵离子。在一些实施方式中，阳离子胺选自伯胺阳离子，仲胺阳离子，叔胺阳离子和季胺阳离子。在一些实施方式中，阳离子胺的浓度为1-50mM。在一些实施方式中，阳离子胺的浓度为1-25mM。在一些实施方式中，该方法包括：(a)用适于在磷灰石固体表面上吸附目标分子的缓冲液组合物平衡磷灰石固体表面，然后使包含目标分子的样品与磷灰石固体表面接触，由此将目标分子吸附到固体表面；(b)在步骤(a)之后，使包含吸附的目标分子的固体表面与包含磷酸盐和碱金属离子的溶液接触，其中该溶液具有足够的体积和浓度以中和磷灰石固体表面，其中该溶液具有足够低的磷酸盐浓度的离子和离子强度，使得目标分子保持吸附于固体载体，并且其中步骤(a)中的缓冲剂组合物与步骤(b)中的溶液有不同的组成；并且(c)在步骤(b)之后，通过使固体载体和与步骤(b)中的溶液有不同组成的溶液接触，从中和的固体载体上洗脱目标分子，由此纯化样品中的目标分子。在一些实施方式中，步骤(b)中的溶液具有6.5-9.0，或7.0-8.5，或7.5-9.0的pH。在一些实施方式中，磷灰石选自下组：羟基磷灰石，氟磷灰石和羟基氟磷灰石。在一些实施方式中，磷灰石是非陶瓷磷灰石。在一些实施方式中，目标分子是蛋白质。在一些实施方式中，所述蛋白质是抗体。在一些实施方式中，该方法还包括权利要求1的步骤(a)和(b)之间或权利要求1的步骤(b)和(c)之间的一个或多个另外的洗涤步骤。在一些实施方式中，一个或多个另外的洗涤步骤从固体表面除去样品的至少一种组分，同时基本上将目标分子保持在固体载体上。在一些实施方式中，所述组分选自下组中的至少一种：内毒素，宿主细胞蛋白，聚集的目标蛋白质或其他聚集体，中性脂质，带电脂质，多糖，沉淀剂，非目标小分子和聚集的目标蛋白质。在一些实施方式中，磷酸盐的浓度为5-25mM，5-10mM或10-25mM。在一些实施方式中，碱金属离子的浓度为100mM，80mM，60mM或更低。在一些实施方式中，所述固体表面是柱并且所述步骤(b)包括使所述固体表面与至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多个柱体积的所述溶液接触。具体实施方式I.引言这里描述的本专利技术部分基于这样的发现：包含氨基化合物，磺化胺化合物或磷酸盐的中和溶液，与阳离子胺或碱金属离子以及任选的碱土金属离子相联合，能有效地中和用于色谱纯化的磷灰石固体表面，而不显著洗脱待在稍后阶段洗脱的目标分子。本申请提供了一种方法，将目标分子(例如，蛋白质或其他分子)吸附到磷灰石固体表面，用中和溶液中和如本文所述的磷灰石表面，然后用单独的溶液或与中和溶液有不同的组成的溶液洗脱目标分子。中和溶液可以包含氨基化合物，磺酸胺(sulfonateamine)和/或磷酸盐。在合适的条件下，阳离子胺，碱土金属离子或碱金属离子置换磷灰石表面上的水合氢离子，并且氨基化合物，磺酸胺化合物或磷酸盐作为水合氢离子受体起作用，由此除去水合氢离子而不损伤磷灰石固体表面，显著改变溶液的pH，或显著洗脱待纯化的目标化合物。换句话说，本专利技术提供通过在一定条件下与缓冲液接触进行中和，使得缓冲液可以用阳离子交换磷灰石表面上的水合氢离子，其中水合氢离子被中和溶液的另一组分(即，氨基化合物，磺化胺化合物或磷酸盐)螯合(sequester)。中和表面之后，使用不同的溶液来洗脱目标分子。II.定义“中和固体磷灰石表面”是指处理磷灰石表面的表面，使得固体表面含不足以显著影响后续洗脱缓冲液的pH(即导致大于0.2的酸性pH移位)的水合氢离子。“抗体”是指免疫球蛋白、其复合或其片段形式。该术语可包括但不限于：源自人或其它哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外产生的抗体。“抗体”也可包括复合形式，其包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”也可以包括抗体片段，如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其它组成，无论它们是否保留抗原结合功能。“磷灰石固体表面”包括稠合的纳米晶体(陶瓷磷灰石)、微晶或化合的微晶，或大孔球形珠。陶瓷磷灰石包括但不限于陶瓷羟基磷灰石(例如CHTTM)，陶瓷氟磷灰石，或陶瓷羟基氟磷灰石(例如MPCTM)。陶瓷磷灰石是磷灰石矿物的一种形式，其中纳米晶体团聚成颗粒并在高温下熔凝以形成适用于色谱应用的稳定的陶瓷微球。化合的微晶包括但不限于HA(珀尔公司(PallCorp.))。微晶包括但不限于Bio-GelHTP、HT、DNA级HT(伯乐公司(Bio-Rad))和HypatiteC(克拉克森色谱公司(ClarksonChromatography))。羟基磷灰石的大孔球形珠粒包括但不限于CaPureHATM(东曹公司(Tosoh))。“羟基磷灰石”是指包含结构式为Ca10(PO4)6(OH)2的不可溶的磷酸钙的羟基化矿物的混合式载体。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。羟基磷灰石是市售可得的，其可有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。复合材料形式包含包埋在琼脂糖或其它珠的孔内的羟基磷灰石微晶。“氟磷灰石”是指包含结构式为Ca10(PO4)6F2的不可溶的磷酸钙的加氟(fluoridated)矿物的混合式载体。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。氟磷灰石是市售可得的，其有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。“羟基氟磷灰石”是指混合模式载体，其包含具有结构式Ca10(PO4)6FnOH(2-n)的磷酸钙的不溶性羟基化和氟化矿物，其中n是介于0和2之间但不包括0和2的数字。其相互作用的主要模式是磷酰基阳离子交换和钙金属亲和力。羟基氟磷灰石是市售可得的，其有各种形式，包括但不限于：陶瓷形式、晶体形式和复合材料形式。“样品”是指含有感兴趣的目标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纯化样品中目标分子的方法，所述方法包括：(a)用适于在磷灰石固体表面上吸附目标分子的缓冲液组合物平衡磷灰石固体表面，然后使包含目标分子的样品与磷灰石固体表面接触，由此将目标分子吸附到固体表面；(b)在步骤(a)之后，使包含吸附的目标分子的固体表面与包含以下物质的溶液接触：(i)碱性氨基化合物和阳离子胺；(ii)磺化胺化合物和阳离子胺；或(iii)磷酸盐和阳离子胺，其中所述阳离子胺具有足够的体积和浓度以从磷灰石固体表面置换水合氢离子，并且步骤(b)中的缓冲剂具有足够的体积和浓度以中和置换的水合氢离子，其中所述溶液具有足够低的离子强度使得目标分子保持吸附于固体载体，并且其中步骤(a)中的缓冲剂组合物与步骤(b)中的溶液有不同的组成；并且(c)在步骤(b)之后，通过使固体载体和与步骤(b)中的溶液有不同组成的溶液接触，从中和的固体载体上洗脱目标分子，由此纯化样品中的目标分子。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.28 US 62/247,3301.一种纯化样品中目标分子的方法，所述方法包括：(a)用适于在磷灰石固体表面上吸附目标分子的缓冲液组合物平衡磷灰石固体表面，然后使包含目标分子的样品与磷灰石固体表面接触，由此将目标分子吸附到固体表面；(b)在步骤(a)之后，使包含吸附的目标分子的固体表面与包含以下物质的溶液接触：(i)碱性氨基化合物和阳离子胺；(ii)磺化胺化合物和阳离子胺；或(iii)磷酸盐和阳离子胺，其中所述阳离子胺具有足够的体积和浓度以从磷灰石固体表面置换水合氢离子，并且步骤(b)中的缓冲剂具有足够的体积和浓度以中和置换的水合氢离子，其中所述溶液具有足够低的离子强度使得目标分子保持吸附于固体载体，并且其中步骤(a)中的缓冲剂组合物与步骤(b)中的溶液有不同的组成；并且(c)在步骤(b)之后，通过使固体载体和与步骤(b)中的溶液有不同组成的溶液接触，从中和的固体载体上洗脱目标分子，由此纯化样品中的目标分子。2.如权利要求1所述的方法，其中所述阳离子胺是铵离子。3.如权利要求1所述的方法，其中所述阳离子胺选自伯胺阳离子，仲胺阳离子，叔胺阳离子和季胺阳离子。4.如权利要求1所述的方法，其中所述阳离子胺的浓度为1-50mM。5.如权利要求1所述的方法，其中所述阳离子胺的浓度为1-25mM。6.一种纯化样品中目标分子的方法，所述方法包括：(a)用适于在磷灰石固体表面上吸附目标分子的缓冲液组合物平衡磷灰石固体表面，然后使包含目标分子的样品与磷灰石固体表面接触，由此将目标分子吸附到固体表面；(b)在步骤(a)之后，使包含吸附的目标分子的固体表面与包含磷酸盐和碱金属离子的溶液接触，其中该溶液具有足够的体积和浓度以中和磷灰石固体表面，其中该...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·斯奈德，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US