用于测量色氨酸及其代谢物的同位素方法技术

色氨酸降解是控制免疫反应的关键代谢途径，并且证据表明在癌症进展过程中，色氨酸代谢物的产生可能是以自分泌方式促进癌症细胞的恶性表型的免疫逃避的基础。本发明专利技术涉及测量质量标签标记的色氨酸及其代谢物的方法，以及使用标记的分子监测受试者治疗的有效性和治疗后疾病复发、用于分层患者和用于诊断受试者免疫响应抑制的方法。

Isotope method for the measurement of tryptophan and its metabolites

Tryptophan degradation is the key metabolic pathway for the control of immune responses, and evidence suggests that the production of tryptophan metabolites may be the basis of immune evasion in cancer cells in the process of cancer progression. The present invention relates to a method for measuring tryptophan and its metabolites labeled with a quality label, as well as the use of labeled molecules to monitor the effectiveness of the subject treatment and the recurrence of the post treatment disease, for the stratified patient and for the method of diagnosing the immune response inhibition of the subjects.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量色氨酸及其代谢物的同位素方法
本专利技术涉及测量质量标签标记的色氨酸及其代谢物的方法，以及使用标记的分子在受试者中监测治疗和治疗后疾病复发的有效性、用于分层患者和诊断受试者中免疫响应的抑制的方法。
技术介绍
作为癌症新标志的“躲避免疫系统破坏(evadingimmunedestruction)”的最近定义反映了对免疫抑制和逃避作为恶性肿瘤的关键特征有越来越多的认识(1)。在过去的几年中，色氨酸降解已经成为控制免疫反应的关键代谢途径。新出现的证据表明，在癌症进展过程中，经由色氨酸分解代谢酶吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)和/或色氨酸-2,3-双加氧酶(TDO)的犬尿氨酸产生可代表免疫逃避的核心途径，同时也以自分泌的方式促进癌症细胞的恶性表型(2，3)。尽管最近才发现TDO在癌症中的作用(3)，但是基于小鼠癌症模型中的临床前研究(5)，目前正在临床试验中对IDO抑制剂1-甲基-色氨酸结合常规化疗或免疫疗法进行研究(4)。目前正在开发用于治疗癌症的IDO和TDO抑制剂，并且实体瘤中使用IDO抑制剂作为化疗或免疫疗法辅助手段的临床试验目前正在进行。另外，色氨酸降解已经涉及几种靶向疗法的效果。最近的证据表明酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼减少了IDO表达，而IDO代表易普利姆玛(ipilimumab)针对CTLA-4阻断的抗性机制。虽然抑制色氨酸降解作为抑制癌症免疫逃避的手段被研究，但是色氨酸降解的诱导涉及控制自身免疫疾病(6)、过度炎症疾病耐受性(7)、慢性感染和过敏。随着调节色氨酸降解的治疗变得可用，对于将患者针对治疗分层以及评估治疗功效而言，有效且精确地测量色氨酸降解的方法变得越来越相关。通过HPLC、GC-MS或LC-MS常规测量色氨酸及其代谢物。存在基于紫外吸收的HPLC方法，以及特定修饰物质的基于荧光的方法(11-14)。每种方法都有其特定的优点和缺点，这里不详细讨论。然而，当应用质谱方法时，由于除了LC分离和特定片段检测(例如在MS2模式下)外还具有亚ppm精确度的精确质量测量，因此通常可以预期更高的特异性。描述了用于检测色氨酸和连接的分析物的这种基于LC-MS的方法(15-18)。已经建立了基于选择性反应监测(SRM)的方法以使用同位素标记的标准物而能够高灵敏度和高精确度地测量色氨酸和几种代谢物，而且还描述了基于SIM扫描的LC-ESI-MS方法(18)。因此，仍然需要测量色氨酸及其代谢物的方法，该方法可以以优异的特异性、灵敏度和通量进行。
技术实现思路
因此，本专利技术的第一方面提供了用胺反应性质量标签标记的色氨酸和/或其一种或多种代谢物，所述胺反应性质量标签增强质谱中的信号强度。在本专利技术第一方面的一种实施方案中，色氨酸和/或其一种或多种代谢物包含：i.L-色氨酸；ii.D-色氨酸；iii.1-L-甲基-色氨酸；iv.1-D-甲基色氨酸；v.L-犬尿氨酸；vi.D-犬尿氨酸；vii.1-L-甲基-犬尿氨酸；viii.1-D-甲基-犬尿氨酸。质量标签可以是同量异序标签或同位素质量标签。优选地，质量标签是包含氢、碳、氮和/或氧的一个或多个重同位素取代的二甲基哌啶-β-丙氨酸衍生物。第二方面，本专利技术提供了一种测量色氨酸和/或其一种或多种代谢物的方法，其中，该方法包括：a)用一种或多种质量标签标记一种或多种测试样品；b)用一种或多种另外的质量标签标记色氨酸和/或其一种或多种代谢物的纯化或合成制品以形成参照样品，其中，所述另外的质量标签是步骤a)中使用的相同质量标签的同量异序或同位素变体；c)以预定比例将步骤a)的一种或多种标记的测试样品和步骤b)的参照样品混合以形成一种或多种分析混合物；d)通过质谱法分析所述一种或多种分析混合物，其中，通过将色氨酸和/或其一种或多种代谢物的期望质荷比处的信号强度与参照样品中色氨酸或其代谢物的质荷比处的相应信号强度比较来确定测试样品中色氨酸和/或其一种或多种代谢物的量。在该第二方面的一种实施方案中，参照样品包含本专利技术第一方面及其实施方案中定义的色氨酸和/或其一种或多种代谢物。在一些其它实施方案中，该方法使用色氨酸和/或其代谢物的一个或多个转换通过选择性反应监测而进行；其中，该方法包括：i.将所述一种或多种测试样品中色氨酸和/或其代谢物的量与先前确定的量进行比较；或ii.将所述一种或多种测试样品中色氨酸的量与两种或更多种色氨酸代谢物的量的比例进行比较；其中，该方法进一步包括在所述一种或多种测试样品中确定色氨酸代谢的速率和/或程度；其中，所述转换优选如表1和/或表2中所定义的。优选地，步骤i)包括用已知量的相应合成色氨酸和/或其代谢物确定所述一种或多种测试样品中色氨酸和/或其代谢物的量，所述已知量的相应合成色氨酸和/或其代谢物与所述一种或多种测试样品中存在的那些色氨酸和/或其代谢物相同，但具有不同的同量异序质量标签或同位素质量标签。更优选地，不同的质量标签在结构上不同或者包含氢、碳、氮和/或氧的不同重同位素取代。第三方面，本专利技术提供了一种测定色氨酸和/或其一种或多种代谢物的方法，该方法包括：a)将可包含色氨酸和/或其一种或多种代谢物的测试样品与包含色氨酸和/或其一种或多种代谢物的至少两种不同的等分试样的校准样品组合，校准样品的每个等分试样具有不同的已知量的色氨酸和/或其一种或多种代谢物，其中，用一种或多种同量异序质量标签差异化标记所述测试样品和校准样品的每个等分试样，每种质量标签具有质谱分析不同的质量标记基团，从而使得可以通过质谱区分测试样品和校准样品的每个等分试样；b)通过质谱法确定测试样品中色氨酸和/或其一种或多种代谢物的量以及校准样品的每个等分试样中色氨酸和/或其一种或多种代谢物的量，以及针对校准样品的等分试样中色氨酸和/或其一种或多种代谢物的已知和确定量而校准测试样品中色氨酸和/或其一种或多种代谢物的量。优选地，本专利技术第三方面中的色氨酸和/或其一种或多种代谢物，其包括：i.L-色氨酸；ii.D-色氨酸；iii.1-L-甲基-色氨酸；iv.1-D-甲基色氨酸；v.L-犬尿氨酸；vi.D-犬尿氨酸；vii.1-L-甲基-犬尿氨酸；viii.1-D-甲基-犬尿氨酸。在该第三方面的一些实施方案中，测试样品包含色氨酸及其一种或多种代谢物，并且为色氨酸和所述其一种或多种代谢物提供校准样品，和对色氨酸和所述其一种或多种代谢物中的每一种重复步骤(b)。在该第三方面的一些其它实施方案中，该方法包括在步骤(a)之前用一种或多种同量异序质量标签差异化标记每个测试样品或校准样品的每个等分试样的另一步骤，优选地，该方法包括在步骤(a)之前组合差异化标记的等分试样以产生校准样品的另一步骤。在第四方面中，本专利技术提供了一种通过根据本专利技术的第二和第三方面及其实施方案测量色氨酸和/或其代谢物水平来监测受试者治疗有效性的方法。优选地，所述治疗是癌症治疗。在第五方面中，本专利技术提供了一种通过根据本专利技术的第二和第三方面及其实施方案测量色氨酸和/或其代谢物水平来分层受试者的方法。优选地，将受试者分层以用于临床试验。在第六方面中，本专利技术提供了一种通过根据本专利技术的第二和第三方面及其实施方案测量色氨酸和/或其代谢物水平来监测受试者在治疗后癌症复发的方法。优选地，该方法以6个月的间隔进行，优选以3个月的间隔进行。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用胺反应性质量标签标记的色氨酸和/或其一种或多种代谢物，所述胺反应性质量标签增强质谱中的信号强度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.30 GB 1519186.91.用胺反应性质量标签标记的色氨酸和/或其一种或多种代谢物，所述胺反应性质量标签增强质谱中的信号强度。2.根据权利要求1所述的色氨酸和/或其一种或多种代谢物，其中，所述色氨酸和/或其代谢物包括：ix.L-色氨酸；x.D-色氨酸；xi.1-L-甲基-色氨酸；xii.1-D-甲基色氨酸；xiii.L-犬尿氨酸；xiv.D-犬尿氨酸；xv.1-L-甲基-犬尿氨酸；xvi.1-D-甲基-犬尿氨酸。3.根据权利要求1或2中任一项所述的色氨酸和/或其一种或多种代谢物，其中，所述质量标签为同量异序标签。4.根据权利要求1或2中任一项所述的色氨酸和/或其一种或多种代谢物，其中，所述质量标签为同位素质量标签。5.根据权利要求1至4中任一项所述的色氨酸和/或其一种或多种代谢物，其中，所述质量标签是包含氢、碳、氮和/或氧的一个或多个重同位素取代的二甲基哌啶-β-丙氨酸衍生物。6.一种测量色氨酸和/或其一种或多种代谢物的方法，其中，所述方法包括：a)用一种或多种质量标签标记一种或多种测试样品；b)用一种或多种另外的质量标签标记色氨酸和/或其一种或多种代谢物的纯化或合成制品以形成参照样品，其中，所述另外的质量标签是步骤a)中使用的相同质量标签的同量异序或同位素变体；c)以预定比例将步骤a)的一种或多种标记的测试样品和步骤b)的参照样品混合以形成一种或多种分析混合物；d)通过质谱法分析所述一种或多种分析混合物，其中，通过将色氨酸和/或其一种或多种代谢物的期望质荷比处的信号强度与所述参照样品中色氨酸或其代谢物的质荷比处的相应信号强度比较来确定所述测试样品中色氨酸和/或其一种或多种代谢物的量。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述参照样品包含如权利要求1至5中任一项所定义的色氨酸和/或其一种或多种代谢物。8.根据权利要求6或7中任一项所述的方法，其中，所述方法使用色氨酸和/或其代谢物的一个或多个转换而通过选择性反应监测来进行；其中，所述方法包括：i.将所述一种或多种测试样品中色氨酸和/或其代谢物的量与先前确定的量进行比较；或ii.将所述一种或多种测试样品中色氨酸的量与两种或更多种色氨酸代谢物的量的比例进行比较；其中，所述方法进一步包括在所述一种或多种测试样品中确定色氨酸代谢的速率和/或程度；其中，所述转换优选如表1和/或表2中所定义。9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤i)包括用已知量的相应合成色氨酸和/或其代谢物确定所述一种或多种测试样品中色氨酸和/或其代谢物的量，所述已知量的相应合成色氨酸和/或其代谢物与所述一种或多种测试样品中存在的那些色氨酸和/或其代谢物相同，但具有不同的同量异序或同位素质量标签。10.根据权利要求9所述的方法，其中，不同的质量标签在结构上不同或者包含氢、碳、氮和/或氧的不同的重同位素取代基。11.一种测定色氨酸和/或其一种或多种代谢物的方法，所述方法包括：a)将可包含色氨酸和/或其一种或多种代谢物的测试样品与包含色氨酸和/或其一种或多种代谢物的至少两种不同的等分试样的校准样品组合，所述校准样品的每个...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·康卡雷维奇，K·库恩，P·舒尔茨克纳佩，I·H·派克，C·奥皮茨，M·普拉滕，
申请(专利权)人：电泳有限公司，鲁普莱希特卡尔斯大学，德国癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：英国,GB