一种DNA聚合酶和逆转录酶的共固定化方法和应用技术

本发明专利技术属于酶工程领域，具体涉及一种DNA聚合酶和逆转录酶的共固定化方法。该方法包括以下步骤：将海藻酸钠加入至第一缓冲液中，然后加入DNA聚合酶，混合后固定，真空抽干，得到固定化的DNA聚合酶；向固定化的DNA聚合酶中加入第二缓冲液和逆转录酶，混合后固定，真空抽干，然后用所述第二缓冲液进行洗涤；冷冻干燥，即得共固定化的DNA聚合酶和逆转录酶。本发明专利技术通过将DNA聚合酶和逆转录酶的共固定化于同一载体上，不仅能够实现RT‑PCR反应的一步转化，而且可以二者的催化特性结合起来，能够排除某些干扰因素，从而提高二者对RT‑PCR反应的整体催化效率。

Co immobilization of DNA polymerase and reverse transcriptase and its application

The invention belongs to the field of enzyme engineering, in particular to a co immobilization method of DNA polymerase and reverse transcriptase. The method includes the following steps: adding sodium alginate into the first buffer, then adding DNA polymerase, mixing and fixing, vacuum drying, and obtaining the immobilized DNA polymerase; adding second buffer solution and reverse transcriptase into the immobilized DNA polymerase, mixing and vacuum drying, and then using the second buffer. The liquid was scrubbed and freeze-dried, and the immobilized DNA polymerase and reverse transcriptase were obtained. By CO immobilizing the DNA polymerase and reverse transcriptase on the same carrier, the invention can not only realize one step transformation of the reaction of RT PCR, but also combine the catalytic properties of the two, and can eliminate some interference factors, thus improving the overall catalytic efficiency of the two persons to the PCR reaction of the PCR.

【技术实现步骤摘要】
一种DNA聚合酶和逆转录酶的共固定化方法和应用
本专利技术属于酶工程领域，具体涉及一种DNA聚合酶和逆转录酶的共固定化方法和应用。
技术介绍
逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。RT-PCR反应中常用的两种酶是DNA聚合酶和逆转录酶。目前，DNA聚合酶和逆转录酶的保存主要是采用以RT-PCR反应混合液形式浓缩、干燥后在常温下保存，或者加入某种液体试剂在-20℃冻存，这样只能实现短时间保存且易引入其它杂质，难以保持聚合酶良好的活力。多酶固定化技术是指：将多种酶同时固定在同一个载体中或将多种酶通过交联的方式形成共交联酶聚集体的一种技术。多酶共固定化可以发挥多酶的协同作用，能够实现底物到产物的一步转化，在级联反应过程中，可增加酶周围的反应物浓度，并将不同酶的催化特性结合起来，进而能够排除某些干扰因素，从而提高酶的整体催化效率。尽管有文献报道TaqDNA聚合酶可以按照以下方法进行固定化：将6g角叉菜胶浮于200ml的水中，加热溶解，湿热灭菌15min后，冷却至35～50℃，与5μl的酶混匀，趁热滴到预冷的氯化钾本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA聚合酶和逆转录酶的共固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将海藻酸钠加入至第一缓冲液中，然后加入DNA聚合酶，混合后固定，真空抽干，得到固定化的DNA聚合酶；(2)向固定化的DNA聚合酶中加入第二缓冲液和逆转录酶，混合后固定，真空抽干，然后用所述第二缓冲液进行洗涤；(3)冷冻干燥，即得共固定化的DNA聚合酶和逆转录酶。

【技术特征摘要】
1.一种DNA聚合酶和逆转录酶的共固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将海藻酸钠加入至第一缓冲液中，然后加入DNA聚合酶，混合后固定，真空抽干，得到固定化的DNA聚合酶；(2)向固定化的DNA聚合酶中加入第二缓冲液和逆转录酶，混合后固定，真空抽干，然后用所述第二缓冲液进行洗涤；(3)冷冻干燥，即得共固定化的DNA聚合酶和逆转录酶。2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶和逆转录酶的共固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将0.20～0.30重量份海藻酸钠加入至4～6体积份第一缓冲液中，然后加入0.0016～0.0024重量份DNA聚合酶，混合后固定，真空抽干，得到固定化的DNA聚合酶；(2)向所述固定化的DNA聚合酶中加入4～6体积份第二缓冲液和0.0024～0.0036重量份逆转录酶，混合后固定，真空抽干，然后用所述第二缓冲液进行洗涤；(3)冷冻干燥，即得共固定化的DNA聚合酶和逆转录酶。所述重量份与体积份的关系为g/mL。3.根据权利要求1或2所述的DNA聚合酶和逆转录酶的共固定化方法，其特征在于，所述步骤(1)中，反应的具体条件为：反应温度为27～33℃，反应的pH值为6.0～7.0，反应时间为1.5～2.5h。4.根据权利要求1-3任一项所述的DNA聚合酶和逆转录酶的共固定化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应的具体条件为：反应温度为27～33℃，反应的pH值为8.5～9.5，反应时间为2.5～3.5h。5.根据权利要求1-4任一项所述的DNA聚合酶和逆转录酶的共固定化方法，其特征在于，所述第一缓冲液为含有0.1～0.3mol/L氯化钠的磷酸缓冲液；所述第二缓冲液为含有0.1～0.3mol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲液。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，沈颂东，赵芳，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32