一种RNA高通量测序文库的构建方法技术

本发明专利技术提供一种能够对所有不带poly(A)尾的RNA进行高通量测序文库构建的方法，本发明专利技术方法覆盖所有不带poly(A)尾的RNA，包括线性RNA和环状RNA。线性的不带poly(A)尾的RNA，可以直接利用本发明专利技术方法或在打断后进行高通量测序文库构建；环状RNA在打断后，可以利用本发明专利技术方法进行高通量测序文库构建。首先，进行末端延伸反应，使上述的RNA在3’末端延伸出一段同聚物序列。然后，进行连接反应后，使其5’端连接上接头R5A。待连接反应后，对上述RNA连接产物进行纯化，再利用特异的逆转录引物RTP进行逆转录反应，获得相应的cDNA一链。最后，利用与高通量测序平台匹配的引物进行PCR扩增，即可得到高通量测序文库。值得一提的是，本发明专利技术方法在灵敏度上得到了较大提升，尤其适用于微量样品中低起始量RNA的高通量测序文库的构建。

A method of building RNA high throughput sequencing Library

The present invention provides a method for constructing a high flux sequencing library for all RNA without poly (A) tail, which covers all RNA without poly (A) tail, including linear RNA and ring RNA. A linear RNA with no poly (A) tail can be used directly by the invention or construction of a high flux sequencing library after interruption; after a circular RNA is interrupted, the present invention can be used to construct a high flux sequencing library. First, the terminal extension reaction is used to extend the RNA at the 3 'end to form a homopolymer sequence. Then, after connecting reaction, the 5 'end is connected to the upper joint R5A. After the reaction was connected, the above RNA products were purified, and then the reverse transcription RTP was used to reverse the reaction, and the corresponding cDNA chain was obtained. Finally, a high throughput sequencing library can be obtained by PCR amplification using primers matching the high-throughput sequencing platform. It is worth mentioning that the method has been greatly improved in sensitivity and is especially suitable for the construction of high throughput sequencing Library of low starting quantity RNA in microsamples.

【技术实现步骤摘要】
一种RNA高通量测序文库的构建方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种不带poly(A)尾的RNA的高通量测序文库的构建方法，特别涉及微量样品如外泌体及细胞外囊泡中低起始量RNA的高通量测序文库的构建。技术背景小分子RNA(smallRNA)是一大类调控分子，存在于几乎所有的生物体中，其长度一般为18-40个核苷酸(nucleotide，nt)。自1993年首次在秀丽线虫(Caenorhaditselegans)中发现smallRNA后，人们越来越多地意识到smallRNA的重要作用。它们以不同于“经典RNA”的作用方式，参与基因表达与调控、RNA的加工与剪切、蛋白质翻译、遗传“入侵”抑制、配子发生等生物学过程，在基因表达、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程起着重要的作用。根据小RNA的分子特征，可以为为4类：微小RNA(microRNA，miRNA)、piRNA(piwi-associatedRNA)、小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)和核仁小RNA(snoRNA,smallnucleolarRNA)，其中miRNA的研究较多，进展最快。作为典型的线性的不带poly(A)尾的RNA，miRNA是一类长度为19-25nt的小分子RNA，最早在线虫中发现。lin-4和let-7这2种miRNA通过部分序列互补结合到靶mRNA的3’非编码区，调控线虫发育过程。在高通量测序技术诞生之前，miRNA的发现和研究速度一直较慢，这是由于传统的Sanger测序法操作复杂，花费大，测序深度有限，效率较低。自2005年以来，高通量测序技术被广泛用来发掘miRNA。高通量测序技术具有速度快、成本低、覆盖度深、产出巨大等优点，因此非常适合miRNA测序，尤其是对那些拷贝数低的miRNA。截止2016年12月，SangermicroRNA序列数据库miRBase(http://www.mirbase.org/)已经收录2800多种miRNA，其中人类成熟体miRNA有2500多种。研究表明，miRNA的异常表达与特定的癌症、疾病的发生和发展相关。在肿瘤研究领域，利用高通量测序手段，对miRNA的表达谱进行分析，寻找某些肿瘤中可能出现异常表达的miRNA，就可能找到作为肿瘤诊断和预后判断的新型生物标志物。当前，以高通量测序技术结合生物信息学分析已成为研究miRNA的一个非常重要的手段。与线性RNA相比，环状RNA(circularRNA,circRNA)受到的关注比较少，也比较难于研究。环状RNA是一类具有特殊未知功能的RNA，而且是客观大量存在的。环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成。环状RNA很难与其它RNA区分开，扩增或片段化会破坏RNA环，而且早期RNA测序的分析算法会过滤掉环状RNA的标志性序列。由于技术和方法学问题，环状RNA一直被视为是罕见的剪切错误，从而把这部分客观存在的RNA忽略了。随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环状的RNA分子，环状RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。在生物信息学、生化分析和深度测序的帮助下，研究者们对这些神秘分子有了空前的认识。对于环状RNA的功能，目前有几种假定的说法：(1)环状RNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能；(2)环状RNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；(3)环状RNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性；(4)环状RNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。在对circRNA结构和功能研究的基础上，有研究人员发现它们在动脉粥样硬化、神经系统紊乱、糖尿病和肿瘤等疾病发生过程中都发挥非常重要的作用。对环状RNA研究具有重要的意义：(1)环状RNA独具的竞争性内源(ceRNA)特征可为药物开发提供新的思路；(2)环状RNA的组织特异性和稳定性有可能使circRNA成为一种良好的生物标志物；(3)环状RNA的研究为生命的进化研究提供新的方向。目前对于不带poly(A)尾的RNA高通量测序文库构建方法主要有两种，即随机引物法和接头连接法。第一种随机引物法是将RNA利用随机引物逆转录成cDNA，然后合成双链的DNA，加上接头，从而完成文库的构建。这种方法虽然简单，但是在文库构建的过程中，容易导致小片段的RNA丢失。第二种方法是接头连接法，这种方法也是目前主流建库试剂盒所采用的方法。该方法是在去磷酸化RNA的3’端加上RNA接头，再对连接产物的5’端进行磷酸化处理，使其加上5’端的RNA接头，然后进行逆转录反应以及PCR扩增，从而完成文库的构建。该方法的主要问题是接头之间容易发生自连，从而会影响后续的测序数据的质量和产出。此外，该建库方法对RNA的起始量通常要求较高，一般要求在10ng以上。然而，在液体活检领域，体液来源的RNA含量通常都比较低，利用常规RNA建库方法常常需要相当多的体液样品。例如，利用传统的基于接头连接的RNA建库方法，全血样品至少需要10ml才能满足建库要求。因此，传统的建库方法的灵敏度已无法满足此类低丰度RNA的建库要求。液体活检领域亟待一种高灵敏度特别是能适用于所有不带poly(A)尾RNA的高通量测序文库构建方法。
技术实现思路
针对现有技术中存在的对不带poly(A)尾的RNA进行建库测序灵敏度及有效率均较低的问题，尤其是无法高效地对外泌体及细胞外囊泡等微量样品中不带poly(A)尾的RNA进行建库的问题，本专利技术提供了一种能针对获所有的不带poly(A)尾的RNA，并对其高效构建测序文库的方法。本专利技术所述的RNA高通量测序文库的构建方法包括以下步骤：(1)进行末端延伸反应，使poly(A)-RNA在其3’末端延伸出一段序列；(2)进行连接反应，使上述RNA在其5’端连接上接头R5A，得到RNA连接产物；(3)对上述RNA连接产物进行纯化；(4)利用特异的逆转录引物RTP对上述纯化后的RNA连接产物进行逆转录反应，获得相应的cDNA一链；(5)进行PCR扩增富集，即得到高通量测序文库。图1示意了利用该专利技术方法进行RNA高通量测序文库构建的流程图。在该方法中，RNA在经过末端延伸反应后，其3’端为一段同聚物。该同聚物由A、T、C、G或U这五种碱基中的任意一种组成，优选地为碱基A。本专利技术中的末端延伸法理论上可以无偏差地使所有RNA在3’端都延伸出一段同聚物，因此可以完整地、准确地反应样品中RNA转录本的真实状态。在该方法中，5’端接头R5A由两段序列构成：位于5’端的特异序列和位于3’端的唯一识别序列。其中，5’端特异序列为高通量测序平接头的3’端序列或完整全长序列；3’端唯一识别序列为由A、T、C和G这四种碱基组成的随机序列，长度为5nt。特别地，在该方法中，由于R5A的5’端是未经磷酸化修饰的，且连接反应体系中没有3’端接头，因此不会造成接头之间的自连，从而可以避免对测序数据质量的影响。此外，R5A3’端含有一段连续的随机序列，一方面可以作为唯一识别序列，便于在后续数据分析时剔除PCR偏差带来的影响，另一方面还可以在一定程度上提高其与RNA之间的连接效本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)进行末端延伸反应，使不带poly(A)尾的RNA在3’末端延伸出一段序列；(2)进行连接反应，使上述RNA在其5’端连接上接头R5A，得到RNA连接产物；(3)对上述RNA连接产物进行纯化；(4)利用特异的逆转录引物RTP对上述纯化后的RNA连接产物进行逆转录反应，获得相应的cDNA一链；(5)进行PCR扩增富集，即得到高通量测序文库。

【技术特征摘要】
1.一种RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)进行末端延伸反应，使不带poly(A)尾的RNA在3’末端延伸出一段序列；(2)进行连接反应，使上述RNA在其5’端连接上接头R5A，得到RNA连接产物；(3)对上述RNA连接产物进行纯化；(4)利用特异的逆转录引物RTP对上述纯化后的RNA连接产物进行逆转录反应，获得相应的cDNA一链；(5)进行PCR扩增富集，即得到高通量测序文库。2.根据权利要求1所述的RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，3’端延伸序列为一段同聚物序列。3.根据权利要求2所述的同聚物序列，其特征在于同聚物由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或尿嘧啶(U)这五种碱基中的任意一种组成，优选地为碱基A。4.根据权利要求1所述的NRA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，5’端接头R5A由两段序列构成：5’端的一段特异序列和3’端的一段唯一识别序列。5.根据权利要求4所述的5’端接头R5A，其特征在于，5’端特异序列为高通量测序平接头的3’端序列或完整全长序列。6.根据权利要求4所述的5’端接头R5A，其特征在于，3’端唯一识别序列为由A、T、C和G这四种碱基组成的随机序列，长度为5nt。7.根据权利要求5及权利要求6所述的5’端接头R5A，其特征在于，其序列包含SeqIDNo:1。8.根据权利要求1所述的RNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，逆转录引物RTP由5’端的特异序列和3’端的特异序列两部分序列构成。9.根据权利要求7所述的逆转录引物RTP，其特征在于，5’端的特异序列为高通量测序平台接头的3’端序列或完整全长序列。10.根据权利要求7所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘月星，李辉辉，
申请(专利权)人：刘月星，李辉辉，
类型：发明
国别省市：上海,31