The invention belongs to the field of bioengineering technology, in particular to a method for preparing ferulic decarboxylase. The preparation methods of the ferulic acid decarboxylase include: (1) the production of ferulic acid decarboxylase by microorganism, centrifugation, cell fragmentation, pH value and ionic strength of cell breakage; (2) preparation of anti gel mass solution and reverse extraction aqueous solution; (3) extraction of ferulic acid decarboxylase by reverse micelles; (4) reverse extraction, The aqueous solution containing ferulic acid decarboxylase was obtained. (5) ferulic decarboxylase product was prepared by ultrafiltration membrane filtration and freeze drying. The invention can realize the scale and continuity of the preparation of ferulic acid decarboxylase, and the production process of the enzyme is simple, the production cycle is short, the recovery rate of enzyme activity is high, and the production cost of ferulic acid decarboxylase is low.
【技术实现步骤摘要】
一种制备阿魏酸脱羧酶的方法
本专利技术属于生物工程
,特别涉及一种制备阿魏酸脱羧酶的方法。
技术介绍
阿魏酸脱羧酶(Ferulicaciddecarboxyase,FAD)是催化阿魏酸发生非氧化脱羧反应产生4-乙烯基愈创木酚的酶,也是阿魏酸代谢产生香兰素(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)的关键酶。4-乙烯基愈创木酚能产生特殊香味或丁香类香味,能提高食品的感官品质,主要用于食品以增加其香味成份,还用于烟草、日化、医药、香精合成等行业。香兰素的香气幽雅、微甜,广泛应用于化妆品、香烟及食品等行业,也用作植物生长促进剂、杀菌剂等,还用于食品中作防腐剂、保鲜剂和抗氧化剂。利用游离或固定化阿魏酸脱羧酶生产4-乙烯基愈创木酚和香兰素具有很大的潜力,日益得到重视,与微生物细胞反应相比,可避免细胞自身代谢产物对产品的污染、简化产物的分离纯化过程、降低生产成本。目前阿魏酸脱羧酶的生产和纯化逐渐形成产业,具有很好的市场前景。阿魏酸脱羧酶的制备主要采用微生物发酵法,该方法包括微生物培养和酶的分离纯化,在生产成本构成中,分离纯化等下游工序的成本占有相当大的比重,因此,如何采用高效的分离技术是阿魏酸脱羧酶生产中需要解决的技术问题。目前,阿魏酸脱羧酶的分离纯化方法主要采用盐析法、离子交换法等,如顾雯(云南大学博士论文,2011)通过亲和层析等方法获得了纯化的阿魏酸脱羧酶;如专利文件CN1206045(申请号98106195.8)公开了硫酸铵盐析、离子交换层析、疏水层析等对阿魏酸脱羧酶进行分离纯化的方法;如专利文件CN101397568(申请号200810233517.X)采用了亲和层 ...
【技术保护点】
1.一种制备阿魏酸脱羧酶的方法,其特征为,包括以下步骤:(1)将产阿魏酸脱羧酶的微生物培养,得细胞培养液,离心,制得菌体细胞,将细胞重悬于去离子水中,制得细胞质量百分比浓度为25~35wt%的溶液,破碎细胞,得细胞破碎液;调破碎液pH值为9.0~10.0,用氯化钠调破碎液的离子强度为0.05~0.25mol/L,制得阿魏酸脱羧酶细胞破碎液;(2)将正己烷与己醇按体积比(10~20):1混合均匀,在混合液中加入表面活性剂,使表面活性剂浓度为100~200mmol/L,制得反胶团体系溶液;将正丁醇加入到0.10~0.20mol/L的柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液中,使正丁醇的质量百分比浓度为5~20wt%,用氯化钠调缓冲液的离子强度为1.5~2.5mol/L,制得反萃取水相溶液;(3)在15~30℃下,将步骤(1)制得的细胞破碎液与步骤(2)制得的反胶团体系溶液按体积比(2~15):1混合均匀,离心,取有机相,制得阿魏酸脱羧酶有机溶液;(4)在25~35℃下,将步骤(3)制得的阿魏酸脱羧酶有机溶液与步骤(2)制得的反萃取水相溶液按体积比(2~10):1混合均匀,离心,制得阿魏酸脱羧酶水溶液;(5) ...
【技术特征摘要】
1.一种制备阿魏酸脱羧酶的方法,其特征为,包括以下步骤:(1)将产阿魏酸脱羧酶的微生物培养,得细胞培养液,离心,制得菌体细胞,将细胞重悬于去离子水中,制得细胞质量百分比浓度为25~35wt%的溶液,破碎细胞,得细胞破碎液;调破碎液pH值为9.0~10.0,用氯化钠调破碎液的离子强度为0.05~0.25mol/L,制得阿魏酸脱羧酶细胞破碎液;(2)将正己烷与己醇按体积比(10~20):1混合均匀,在混合液中加入表面活性剂,使表面活性剂浓度为100~200mmol/L,制得反胶团体系溶液;将正丁醇加入到0.10~0.20mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,使正丁醇的质量百分比浓度为5~20wt%,用氯化钠调缓冲液的离子强度为1.5~2.5mol/L,制得反萃取水相溶液;(3)在15~30℃下,将步骤(1)制得的细胞破碎液与步骤(2)制得的反胶团体系溶液按体积比(2~15):1混合均匀,离心,取有机相,制得阿魏酸脱羧酶有机溶液;(4)在25~35℃下,将步骤(3)制得的阿魏酸脱羧酶有...
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