间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，提供一种间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法。一种间充质干细胞的分离培养方法，包括：获取间充质干细胞原代细胞；间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞的分离。该间充质干细胞的分离培养方法，能得到具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应的间质干细胞。并且针对上述间充质干细胞的分离培养方法所得到的间质干细胞，本发明专利技术还提供一种间充质干细胞的冻存、复苏方法，能很好的保存并复苏该间质干细胞。

Isolation, culture, cryopreservation and resuscitation of mesenchymal stem cells

The invention relates to the field of biotechnology, providing a method for isolation and cultivation of mesenchymal stem cells, and a method for cryopreservation and resuscitation. A method for isolation and culture of mesenchymal stem cells, including: obtaining primary cells from mesenchymal stem cells, culture and amplification of mesenchymal stem cells: isolation of mesenchymal stem cells. The method of isolation and culture of mesenchymal stem cells can obtain mesenchymal stem cells with good cell quality, safety and biological effects. In addition to the mesenchymal stem cells derived from the separation and culture of mesenchymal stem cells, the invention also provides a cryopreservation and resuscitation method for mesenchymal stem cells, which can well preserve and resuscitation the mesenchymal stem cells.

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法。
技术介绍
干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞。干细胞治疗是指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后(或植入)人体，用于疾病治疗的过程。这种体外操作包括干细胞的分离、纯化、扩增、冻存和冻存后的复苏等过程。目前国内外已经开展了多种干细胞类型的临床应用研究，涉及的主要疾病类型包括骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应(GVHD)、脊髓损伤及退行性神经系统疾病和糖尿病等。其中由于间充质干细胞(MSCs)具有一定的多向分化潜能及抗炎和免疫调控能力等，广泛应用于临床各种疾病的治疗。开展临床试验治疗，需要制备大量的细胞，而用于干细胞治疗的细胞制备技术具有多样性、复杂性和特殊性。作为一种新型的生物治疗产品，干细胞制剂除了像其他细胞制品一样遵循一个共同的研发过程，即从细胞制剂的制备、体外实验、体内动物实验，到植入人体的临床研究即临床治疗的过程外，还具备其特殊性。这种特殊性就是干细胞是最原始的细胞，任何细微的微环境改变都会影响其功能的发挥。而在干细胞制备过程中，从体内干细胞分离出来后，干细胞的性质就开始发生变化，因此如何操作以确保干细胞具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应等，是一个亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法，能得到具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应的间质干细胞，并且能很好的保存并复苏该间质干细胞。为解决上述技术问题，专利技术采用如下所述的技术方案。一种间充质干细胞的分离培养方法，包括：获取间充质干细胞原代细胞；间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞原代细胞培养5-10天后换成无血清DMEM营养液，至细胞65～75％融合，移去培养上清液，然后添加第一消化液，消化0.5-2min，细胞收缩后加入所移去的培养上清液中和后进行离心分离，重新加入完全培养基重悬，按照1传1～1.5接种，培养4～5天后，细胞65～75％融合时以1：6～8的比例进行传代培养；及间充质干细胞的分离：收集间充质干细胞原代细胞的培养扩增中的处于P2或P3对数生长期且细胞融合程度不超过80％的细胞，按传代的要求消化、中和、洗涤后即可收集得到所需的间充质干细胞。优选地，所述第一消化液为0.25％胰蛋白酶-EDTA。优选地，所述的进行离心分离为在800～1200转/分下离心6～10min。优选地，所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞或自体脂肪间充质干细胞原代细胞或脐带间充质干细胞原代细胞。优选地，所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：抽取骨髓液并稀释：用含500U/ml肝素的PBS液的注射器抽取骨髓液，混合均匀后用含20U/ml肝素的PBS液稀释得到骨髓缓冲液；细胞的分离与纯化：将骨髓缓冲液中加入比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液上，通过离心分离纯化单个核细胞群，然后用DMEM培养液离心洗涤得到沉淀；及细胞扩增培养：将离心分离后得到的沉淀利用无血清培养液混悬，按5×106/mL的密度进行接种并于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养；培养3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次，共培养6天即可得到骨髓间充质干细胞原代细胞。优选地，所述间充质干细胞原代细胞为自体脂肪间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：抽取自体脂肪颗粒并剪碎：抽取自体脂肪颗粒，剔除可见微血管及肌肉组织，用PBS进行洗涤，然后将脂肪组织剪碎至糊状使其小于1mm3；细胞的分离与纯化：往糊状的脂肪组织中添加第二消化液进行消化，消化后过滤收集滤液，然后使用含有10％FBS的低糖DMEM培养基进行中和，再离心得到沉淀；及细胞扩增培养：往经过细胞的分离与纯化后得到的沉淀中加入无血清培养基，以1×106/mL的密度进行接种，并于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养；培养3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次，共培养6天即可得到自体脂肪间充质干细胞原代细胞。优选地，所述第二消化液为含有0.1％胶原酶I型和0.05％胰蛋白酶的无血清DMEM。优选地，所述间充质干细胞原代细胞为脐带间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：处理脐带：取脐带并剪断，剪断后的脐带总长度大于15cm，用生理盐水清洗后，再用含2倍双抗生理盐水去除血渍，接着去除血管与外膜，剥离华尔通胶并剪成0.5～1mm3；及细胞扩增培养：将剪碎的华尔通胶涂布于培养皿上，加入无血清完全培养基，于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养，培养7～10天即可得到脐带间充质干细胞原代细胞。一种间充质干细胞的冻存、复苏方法，将上述间充质干细胞的分离培养方法所得到的间充质干细胞进行冻存及复苏，包括：间充质干细胞的冻存：用细胞冻存液重悬所述间充质干细胞，然后置于装有异丙醇的容器中，于-90～-70℃下过夜后移入液氮罐；及间充质干细胞的复苏：取冻存的间充质干细胞立即投入40～45℃水浴中融化，然后加入完全培养基并混匀，离心处理后弃去上清液，以完全培养基重悬后于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养，待65～75％的细胞贴壁即可。优选地，所述间充质干细胞的冻存中的细胞冻存液由90％胎牛血清及10％DMSO组成。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种间充质干细胞的分离培养方法，能得到具有良好的细胞质量、安全性以及生物学效应的间质干细胞。并且针对上述间充质干细胞的分离培养方法所得到的间质干细胞，还提供一种间充质干细胞的冻存、复苏方法，能很好的保存并复苏该间质干细胞。附图说明图1是本专利技术实施例一中间充质干细胞的分离培养方法的流程示意图。图2是本专利技术实施例一的第一种实施方式中获取间充质干细胞原代细胞的流程示意图。图3是本专利技术实施例一的第二种实施方式中获取间充质干细胞原代细胞的流程示意图。图4是本专利技术实施例一的第三种实施方式中获取间充质干细胞原代细胞的流程示意图。图5是本专利技术实施例二中间充质干细胞的冻存、复苏方法的流程示意图。具体实施方式为使本领域的普通技术人员更加清楚地理解专利技术的目的、技术方案和优点，以下结合附图和实施例对专利技术做进一步的阐述。实施例一如图1所示，一种间充质干细胞的分离培养方法，包括：步骤S1：获取间充质干细胞原代细胞；步骤S2：间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞原代细胞培养5-10天后换成无血清DMEM营养液，至细胞65～75％融合，移去培养上清液，然后添加第一消化液，消化0.5-2min，细胞收缩后加入所移去的培养上清液中和后进行离心分离，重新加入完全培养基重悬，按照1传1～1.5接种，培养4～5天后，细胞65～75％融合时以1：6～8的比例进行传代培养；及步骤S3：间充质干细胞的分离：收集间充质干细胞原代细胞的培养扩增中的处于P2或P3对数生长期且细胞融合程度不超过80％的细胞，按传代的要求消化、中和、洗涤后即可收集得到所需的间充质干细胞。本专利技术所提供的一种间充质干细胞的分离培养方法，通过确定间充质干细胞原代细胞的培养扩增以及间充质干细胞的分离中的具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：包括：获取间充质干细胞原代细胞；间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞原代细胞培养5‑10天后换成无血清DMEM营养液，至细胞65～75％融合，移去培养上清液，然后添加第一消化液，消化0.5‑2min，细胞收缩后加入所移去的培养上清液中和后进行离心分离，重新加入完全培养基重悬，按照1传1～1.5接种，培养4～5天后，细胞65～75％融合时以1：6～8的比例进行传代培养；及间充质干细胞的分离：收集间充质干细胞原代细胞的培养扩增中的处于P2或P3对数生长期且细胞融合程度不超过80％的细胞，按传代的要求消化、中和、洗涤后即可收集得到所需的间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：包括：获取间充质干细胞原代细胞；间充质干细胞原代细胞的培养扩增：间充质干细胞原代细胞培养5-10天后换成无血清DMEM营养液，至细胞65～75％融合，移去培养上清液，然后添加第一消化液，消化0.5-2min，细胞收缩后加入所移去的培养上清液中和后进行离心分离，重新加入完全培养基重悬，按照1传1～1.5接种，培养4～5天后，细胞65～75％融合时以1：6～8的比例进行传代培养；及间充质干细胞的分离：收集间充质干细胞原代细胞的培养扩增中的处于P2或P3对数生长期且细胞融合程度不超过80％的细胞，按传代的要求消化、中和、洗涤后即可收集得到所需的间充质干细胞。2.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述第一消化液为0.25％胰蛋白酶-EDTA。3.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述的进行离心分离为在800～1200转/分下离心6～10min。4.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞或自体脂肪间充质干细胞原代细胞或脐带间充质干细胞原代细胞。5.如权利要求4所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞原代细胞为骨髓间充质干细胞原代细胞，所述获取间充质干细胞原代细胞包括：抽取骨髓液并稀释：用含500U/ml肝素的PBS液的注射器抽取骨髓液，混合均匀后用含20U/ml肝素的PBS液稀释得到骨髓缓冲液；细胞的分离与纯化：将骨髓缓冲液中加入比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液上，通过离心分离纯化单个核细胞群，然后用DMEM培养液离心洗涤得到沉淀；及细胞扩增培养：将离心分离后得到的沉淀利用无血清培养液混悬，按5×106/mL的密度进行接种并于35～40℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养；培养3天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3d更换培养液1次，共培养6天即可得到骨髓间充质干细胞原代细胞。6.如权利要求4所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于：所述间充质干细胞原代细胞为自体脂肪间充质干细胞原代细胞，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨涛，隋昳，
申请(专利权)人：深圳至博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44