一种抗菌肽及其应用制造技术

一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。本发明专利技术在对猪源抗菌肽PMAP‑36的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将猪源抗菌肽PMAP‑36氨基酸序列中的5处氨基酸进行突变，分别是L7V，T11S，I18E，I25A和I32A，获得了一种抗菌活性更高、安全性更好的抗菌肽产品。

An antibacterial peptide and its application

An antimicrobial peptide is characterized in that the amino acid sequence of the antibacterial peptide is SEQ ID No.1. On the basis of the spatial structure analysis of the amino acid sequence of the porcine antimicrobial peptide PMAP 36, 5 amino acids in the PMAP 36 amino acid sequence of the pig source antibacterial peptide were mutated, which were L7V, T11S, I18E, I25A and I32A, and a better antibacterial peptide product was obtained with higher antibacterial activity and better safety.

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽及其应用
：本专利技术涉及生物
，具体涉及一种抗菌肽及其应用。
技术介绍
：我国是世界上最大的抗生素生产和使用国，也是抗生素滥用和细菌耐药性的重灾区。抗生素滥用，特别是畜牧业领域尤其严重。畜牧业养殖户之所以喜欢使用抗生素,原因在于抗生素不仅可以防病治病,而且还能促进动物生长、提高产量，许多养殖户普遍将饲用抗生素添加到饲料中，当做保健品来促生长。而这导致的“超级细菌”风险、环境污染加重等问题，正在挑战国人健康底线，兽用抗生素所导致的细菌抗药性和所产生的“超级细菌”，不会局限于禽畜,也会影响到人类。数据显示，全国2013年使用的16.2万吨抗生素中，兽用52%，人用48%，一年超过5万吨抗生素排放进水土环境中。2014年以来，抗生素使用量仍在上升，其中绝大部分是作为饲料添加剂而不是治疗疾病使用。抗生素由于具有药物残留及细菌耐药性问题，因此迫切需要发现一种绿色、无污染和无细菌耐药性的抗生素替代物。抗菌肽（antimicrobialpeptide）是一种具广谱抗菌、抗病毒甚至抗寄生虫活性的阳离子短肽，是生物体内广泛存在一种具有抗菌作用的活性多肽，是生物非特异性防御系统的免疫应答产物，具有广谱抗菌活性，可以抑制多种细菌或真菌的生长。抗菌肽由于其主要通过物理渗透作用于细菌胞膜而产生抑菌或者杀菌作用，而细菌等微生物很难改变其自身磷脂双分子层的胞膜结构，因此使得抗微生物肽产生耐药性的几率大大降低。并且大部分抗菌肽具有热稳定性高的特点，所以抗菌肽越来越引起人们的重视。抗菌肽广泛存在于微生物以及动植物体内，目前已发现的抗菌肽有1800多种。至今在鱼类中鉴定出的抗菌肽包括hepcidin，defensins，pleurocidin，piscidin，moronecidin，misgurain，pardaxin，parasin，LEAP-2和NK-lysin等数十种。抗菌肽的研究已成为基因工程和药物开发等领域的研究热点，具有极为广阔的市场应用前景。专利技术专利申请CN201510084023.X公开了一种抗菌肽C-BF在制备防治仔猪断奶应激药物中的应用；抗菌肽C-BF能改善肠道形态，增加绒毛高度，缓解肠道炎症，提高断奶仔猪生长性能，减少腹泻率；抗菌肽C-BF通过腹腔注射给药。专利技术专利申请CN201410669038.8通过生物软件对猪源抗菌肽PR-39的氨基酸序列进行空间结构分析，将其39个氨基酸中的3处氨基酸进行突变，获得一种新型猪源抗菌肽PR-39突变体，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型猪源抗菌肽PR-39突变体基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂用于畜禽疾病的预防和治疗。专利技术专利申请CN200710176477.5公开了一种提取猪血抗菌肽的方法，该方法包括以下步骤：1)将猪血粉溶入缓冲液中，然后在混合液中加入木瓜蛋白酶进行酶解，调整酶解液的pH为3.5～4.5；2)将氯仿和亚硫酸氢钠加入到所述酶解液中进行脱色，然后调整脱色后酶解液的pH值至6.0～7.0，成为猪血抗菌肽的粗提物。为了得到猪血抗菌肽的精制品，对所述粗提物进行以下纯化步骤：1)冷冻干燥所述猪血抗菌肽的粗提物，并将所述粗提物过凝胶型阳离子交换柱，对交换柱进行洗脱，收集洗脱液；2)对所述洗脱液进行真空冷冻干燥，成为猪血抗菌肽。翟少伟（水生生物学报）等研究了饲料中添加抗菌肽Surfactin对吉富罗非鱼肠道健康指标的影响，试验表明,吉富罗非鱼饲料中适量添加抗菌肽Surfactin可增加肠道皱襞高度、调节肠道菌群和提高肠道抗氧化能力而改善肠道健康状态。李伦锋（中国动物传染病学报）等以猪链球菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪支气管败血波氏杆菌、猪致病性大肠杆菌、化脓性链球菌7株猪呼吸道常见菌为实验菌,检测猪小肠抗菌肽对常见的猪呼吸道菌的抑菌效果。结果显示,猪小肠抗菌肽对这7株呼吸道菌均有不同程度的抑菌作用,对化脓性链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用最为明显,最小抑菌浓度均为49.5μg/mL,对猪链球菌和大肠杆菌也有较为明显的抑菌活性,而对猪支气管败血波氏杆菌的最小抑菌浓度为398μg/mL。尽管抗生肽的研究较多，但是也存在一些问题，例如，抗菌活性低，对于正常细胞如红细胞等也造成溶血作用等等问题。
技术实现思路
：基于现有技术中抗菌肽生产和使用中存在的诸多问题，以及丰富抗菌肽种类的考虑，本专利技术旨在提高一种新的抗菌肽，其通过对猪源抗菌肽PMAP-36进行改造，获得了一种抗菌活性更高、安全性更好的抗菌肽产品。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种猪源抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQIDNo.1。所述SEQIDNo.1的氨基酸序列为：VGRFRRVRKKSRKRLKKEGKVLKWAPPIVGSAPLGCG。本专利技术所述的抗菌肽相比原始的猪源抗菌肽PMAP-36氨基酸序列（SEQIDNo.2）中的5处氨基酸进行突变，分别是L7V，T11S，I18E，I25A和I32A。所述原始的猪源抗菌肽PMAP-36氨基酸序列为SEQIDNo.2：VGRFRRLRKKTRKRLKKIGKVLKWIPPIVGSIPLGCG。本专利技术还请求保护氨基酸序列为SEQIDNo.1的猪源抗菌肽在制备治疗仔猪腹泻的药物中的应用。其中所述药物为口服液饮剂，所述抗菌肽在该药物中的浓度为20μg/mL。其中所述药物用于治疗仔猪腹泻时，每头份服用饮剂5mL。本专利技术还请求保护氨基酸序列为SEQIDNo.1的猪源抗菌肽在制备畜禽饲料添加剂中的应用，所述饲料添加剂能够预防和/或治疗由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡沙门氏菌和猪副伤寒沙门氏菌等致病菌所导致的疾病。本专利技术在对猪源抗菌肽PMAP-36的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将猪源抗菌肽PMAP-36氨基酸序列中的5处氨基酸进行突变，分别是L7V，T11S，I18E，I25A和I32A，获得了一种抗菌活性更高、安全性更好的抗菌肽产品。附图说明：图1：通过分析软件模拟的猪源抗菌肽PMAP-36改造后和改造前的二级结构模型。其中A为本专利技术的抗菌肽，即改造后的猪源抗菌肽PMAP-36；B为原始的猪源抗菌肽PMAP-36。图2：抑菌试验。其中阳性对照为氨苄青霉素溶液，阴性对照为蒸馏水，A和B孔分别滴加浓度为50μg/ml的改造后的猪源抗菌肽PMAP-36突变体和改造前的PMAP-36（其氨基酸序列为SEQIDNo.2）。具体实施方式：实施例1：猪源抗菌肽PMAP-36突变体的制备第一，猪源抗菌肽PMAP-36(SwissProtID:P49931)是由37个氨基酸组成的抗菌肽。然而，通过结构分析表明，该抗菌肽具有多个折叠结构（参见图1B），不利于抗菌肽的表达和在抗菌过程的穿膜，为了进一步提高其抑菌活性，通过对猪源抗菌肽PMAP-36的氨基酸序列进行空间结构分析，最后完成猪源抗菌肽PMAP-36中5处氨基酸突变(L7V，T11S，I18E，I25A和I32A)，获得猪源抗菌肽PMAP-36突变体，其氨基酸序列为SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQIDNo.1。2.根据权利要求1所述的抗菌肽在制备治疗仔猪腹泻的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其中所述药物为口服液饮剂，所述猪源抗菌肽在该药物中的浓度为20μg/mL。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，曾和华，陈瑞，张志刚，
申请(专利权)人：九江牧威利元科技中心普通合伙，
类型：发明
国别省市：江西,36