本发明专利技术公开了一种大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdPEL1及其应用，该蛋白能提高植物抗病性，可以作为一种诱导植物免疫的诱导子应用到植物病害的防治领域。该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。利用工程菌株表达可以获得高小变大的蛋白，可以用于提高烟草和棉花的抗病性，所涉及的植物病害为烟草花叶病、灰霉病和棉花黄萎病。该蛋白激发子可以明显的提高植物的抗病性，且效果快，作用时间长。VdPEL1为提高植物的抗病性提供了新的途径。
Secretory protein elicitor VdPEL1 of Verticillium dahliae and its application
The invention discloses a kind of VdPEL1 and its application, which can improve plant disease resistance and can be used as an inducer to induce plant immunity to plant disease control. The amino acid sequence of the protein is shown in SEQ ID NO:2. It can be used to improve the disease resistance of tobacco and cotton, and the plant diseases involved are tobacco mosaic, Botrytis cinerea and Verticillium wilt. The Protein Elicitor can obviously enhance the disease resistance of plants, and the effect is fast and the action time is long. VdPEL1 provides a new way to improve plant disease resistance.
【技术实现步骤摘要】
大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdPEL1及其应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)分泌型蛋白激发子。
技术介绍
目前，对植物病害的防治主要采取化学防治和选育抗病品种。但是随着病原菌致病小种的不断进化，对农药产生了抗药性而降低了防治效果，进而导致用药量的不断增加。同时大量使用化学农药导致的农产品安全、生态安全也越备受重视。随着生物技术的发展，植物诱导抗性受到极大关注，激发子作为诱导植物抗性的主要因子，愈发受到关注，并成为生物农药的重要发展方向。因此，从病原菌中分离鉴定出具有新功能的激发子已成为国内外科学家关注的焦点。大丽轮枝菌是植物病原真菌，可侵染38科660种植物，包括农作物184种，主要有棉花、茄子、番茄、烟草、马铃薯、西瓜、黄瓜、花生、大豆等，破坏寄主植物维管束而导致植株萎蔫死亡，造成巨大的经济损失。大丽轮枝菌在侵染植物过程中分泌产生的激发子能激活植物的免疫系统，诱导植物的防御反应，最终使植物产生系统抗性。目前，国内外从大丽轮枝菌中分离鉴定到能够引起植物抗病性的活性成分并不多。2004年，Wang.等人从大丽轮枝菌中分离到一个蛋白激发子VdNEP，该激发子能诱导植物防御反应(J.Y.,Wang.等，应用环境微生物,大丽轮枝菌激发子VdNEP诱导棉花萎蔫.2004,70：4989-95)；2012年，Wang.等人从大丽轮枝菌中分离得到了一种激发子PevD1，该激发子是一种小分子蛋白，分子量为17kDa，研究证明能诱导植物过敏反应，氧爆发和抗病相关蛋白的积累，促进苯丙素合成途径，提升植物基础抗性(B.N.,Wang.等，应用环境微生物，大丽轮枝菌激发子的纯化和鉴定以及诱导烟草抗性反应,2012，93：191-201)。后期实验进一步证明，2012年Wang等人分离得到的蛋白激发子PevD1有效地诱导棉花系统抗病性，减轻棉花黄萎病的发病率(B.Bu,等，植物细胞报告，大丽轮枝菌激发子PevD1诱导棉花黄萎病抗性,2014，33,461-470)。2017年YiZhang等人发现大丽轮枝菌产生的VdCP1也具有蛋白激发子的功能，诱导烟草和棉花的抗病性。所有已公开发表的文献表明，大丽轮枝菌可以产生引起植物的防御反应，提高植物抗性的激发子，其性质和种类各不相同，寻找新的蛋白激发子，不仅对揭示大丽轮枝菌与植物互作机理提供理论依据，更重要的是能为开发提高植物免疫抗性的蛋白质生物农药提供有效的蛋白资源。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdPEL1及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种大丽轮枝菌Verticilliumdahlia分泌型蛋白激发子VdPEL1，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用。本专利技术所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用，其中，所述植物为烟草和棉花。本专利技术所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用，其中，当用于诱导减少烟草花叶病、灰霉病和棉花黄萎病时，所述VdPEL1的诱导浓度为1μM；当用于诱导烟草对烟草花叶病的抗性时，所述VdPEL1的诱导浓度为500nM。一种VdPEL1基因，其中，其核苷酸序列为下列所述之一：(1)编码如SEQIDNO:2所示蛋白质的多核苷酸序列；(2)与上述多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。本专利技术所述的VdPEL1基因，其中，其多核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。也可以是编码如SEQIDNO:2所示蛋白质的氨基酸的密码子的其他组合形式。VdPEL1基因可用于基因工程菌株的表达，表达载体优选pPICZαA，重组载体可用毕赤酵母(PichiapastorisKM71H)表达。得到分子量约29kD的融合表达蛋白(VdPEL1)，可以诱导烟草对灰霉病，烟草花叶病和棉花黄萎病的抗性反应，提高植物抗性。本专利技术所述的蛋白激发子可以通过基因工程手段表达获得重组蛋白。同现有技术相比，本专利技术的突出效果在于：该蛋白激发子可以明显的提高植物的抗病性，浓度低，起效快，作用时间长。VdPEL1为提高植物抗病性、减轻病害发生提供了新的途径，因而在现在农业绿色发展上具有广阔的应用前景。微生物保藏信息编号CGMCCNo.7611，命名Verticilliumdahliae，菌株XH-8，2013年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话010-64807355。下面结合附图说明和具体实施例对本专利技术所述的大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdPEL1及其应用作进一步说明。附图说明图1为蛋白激发子VdPEL1的SDS-GAGE检测图和WesternBlotting检测图；图2为不同浓度下蛋白激发子VdPEL1在烟草叶片的过敏性反应检测；图3为蛋白激发子VdPEL1诱导烟草叶片ROS反应；图4为蛋白激发子诱导抗病相关基因的表达；图5为蛋白激发子VdPEL1诱导烟草抗灰霉病的效果图；图6为蛋白激发子VdPEL1诱导烟草抗花叶病的效果图；图7为蛋白激发子VdPEL1诱导棉花抗黄萎病的效果图。具体实施方式实施例1VdPEL1蛋白的真核表达和纯化(1)VdPEL1蛋白激发子的分离鉴定果胶裂解酶广泛的存在于植物病原菌的分泌物中，且已被验证可以作为蛋白激发子激活植物免疫反应(Poinssot.等,分子植物与微生物互作杂志，一个灰霉菌果胶酶激活葡萄树的免疫响应，2003,553–564.)。基于大丽轮枝菌基因组测序的完成，以及大丽轮枝菌蛋白分泌组学数据，并且结合本实验室前期对蛋白激发子的筛选体系，通过NCBI数据库中的CDD功能对大丽轮枝菌分泌组中的果胶裂解酶与已上报的激发子进行保守序列比对，同时进行系统发育进化树分析，确定了10个候选蛋白。将10个候选蛋白的编码序列分别构建到瞬时表达载体PYBA1132中，转化农杆菌并注射烟草叶片，三天后观察是否有过敏性反应出现，并用Westernblot检测候选蛋白是否在烟草中表达。根据植物免疫反应一过敏性反应有无及强弱，最终确定VdPEL1作为潜在的大丽轮枝菌蛋白激发子。(2)表达载体的构建设计蛋白激发子基因VdPEL1的特异性引物，引入带有保护碱基的酶切位点，正向引物：5’-cggaattcgtcaacaacgtcacccccaa-3’，如SEQIDNO:3所示，(下划线为EcoRI的酶切序列)，反向引物：5’-gctctagaccgcaagccttgacggtggtgt-3’，如SEQIDNO:4所示，(下划线为XbaI的酶切序列)，扩增全长VdPEL1基因(94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，35cycles；72℃5min)。先将VdPEL1基因目的片段克隆到pMD18-Tsimple载体，测序验证获得正确的质粒，然后利用EcoRI和XbaI酶切后，将VdPEL1片段克隆到pPICZαA载体(Invitrogen)的EcoRI/XbaI位点。将重组载体pPICZαA-VdPEL1转化到大肠杆菌TransT1菌株中，进行大量培养，提本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大丽轮枝菌Verticillium dahlia分泌型蛋白激发子VdPEL1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种大丽轮枝菌Verticilliumdahlia分泌型蛋白激发子VdPEL1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。2.权利要求1所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用。3.根据权利要求2所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用，其特征在于：所述植物为烟草和棉花。4.根据权利要求3所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用，其特征在于：当用于诱导减少烟草花叶病、灰霉病和棉花黄萎病时，所述VdPEL1的诱导浓度为1μM；当用于诱导烟草对烟草花叶病的抗性时，所述VdPEL1的诱导浓度为500nM。5.一种VdPEL1基因，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱德文，杨远坤，杨秀芬，曾洪梅，郭立华，袁京京，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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