甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条及其制备方法、检测方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条及其制备方法，所述甲型流感病毒IgA抗体免免疫荧光检测试纸条包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和背板；所述硝酸纤维素膜包括甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段的检测线和人IgA抗体对照线；所述标记垫设有抗人IgA抗体‑荧光微球标记物。本发明专利技术提供的检测试纸，具有极高检测的灵敏度，无需借助价格昂贵的PCR检测仪，用肉眼即可得知检测结果，实现对甲型流感病毒的快速筛查。本发明专利技术还提供上述甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条的检测方法和应用，其检测方法，步骤简单，易操作，结果快速，适合广泛推广。

【技术实现步骤摘要】
甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条及其制备方法、检测方法和应用
本专利技术属于医学检验领域，涉及一种流感病毒检测试纸条，具体地涉及一种甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条及其制备方法、检测方法和应用。
技术介绍
流感病毒是一种可以感染任何年龄段，可以在全世界范围内感染的病毒，影响力和破坏力极大。流感病毒可以分为甲型流感、乙型流感、丙型流感，其中甲型流感病毒的传染性和危害性最大。根据甲型流感病毒表面血凝素(H蛋白)和神经氨酸酶(N蛋白)不同，可以H可分为17个亚型(H1～H17)，N有10个亚型(N1～N10)。季节性流感是一种由流感病毒引起的急性病毒性感染，中国大陆引起季节性流感的常见甲型流感病毒是H1N1亚型和H3N2亚型。流感病毒感染的症状包括发热、咳嗽、咽痛、流鼻涕等，这些症状与细菌性感冒症状相似，因此临床比较难通过病人的症状判定引起感冒的发病原因，只能通过必要的流感病毒检测方法。目前，由于缺乏流感病毒的检测方法，较难区分流感病毒感染和细菌感染引起的感冒症状，临床通常会使用开抗生素治疗，很多流感病毒患者因此延误病情，另一方面也造成抗生素滥用，潜在引起细菌耐药等社会医疗问题。常见的季节性流感病毒是由甲型流感病毒和乙型流感病毒构成的，甲型流感病毒和乙型流感病毒感染治疗用药不同，甲型流感病毒可以使用金刚烷胺、奥司他韦、扎那米韦等药物，但是市场上常见的抗流感病毒OTC药物金刚烷胺药物对乙型流感病毒没有治疗效果。因此，不仅需要区分流感病毒感染和普通细菌感染，也需要对不同类型的流感病毒进行区分。可见，有必要开发一种甲型流感病毒检测试剂。甲型流感病毒的检测方法发展多年，常见的检测方法包括RT-PCR荧光检测、抗原检测胶体金层析、抗原检测酶联免疫检测、病毒抗原直接免疫荧光检测、病毒血清IgM抗体检测等。其中RT-PCR检测试剂、抗原胶体金层析检测使用较多。RT-PCR检测主要是检测患者咽拭子中病毒的核酸，灵敏度高，特异性强。但由于该检测技术需要价格昂贵的PCR检测仪，另外需要具备一定检测条件的认证实验室，在基层无法推广。抗原胶体金免疫技术直接采集患者的咽拭子，通过肉眼可以判断患者感染流感病毒的情况；但其具有灵敏度低、容易造成漏检的缺点。因此，亟需开发一种甲型流感病毒唾液IgA抗体检测试纸，具有极高检测的灵敏度，无需借助价格昂贵的PCR检测仪，用肉眼即可得知检测结果；其检测方法快速简单，适合广泛推广。
技术实现思路
为了克服现有技术存在的问题，本专利技术的目的是提供一种甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条及其制备方法，免疫荧光检测试纸条具有极高检测的灵敏度，无需借助价格昂贵的PCR检测仪，用肉眼即可得知检测结果；其检测方法快速简单，适合广泛推广。本专利技术的另一目的是提供一种上述甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条的检测方法和应用，其检测方法快速简单，适合广泛推广。为解决上述问题，采用的技术方案如下：本专利技术首先提供了一种甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条包括背板、样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述硝酸纤维素膜包括甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段的检测线和人IgA的抗体对照线；所述标记垫设有抗人IgA抗体-荧光微球标记物。进一步地，所述甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段的氨基酸序列如序列表SeqIDNO.1所示。进一步地，所述抗人IgA抗体选自羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体或兔抗人IgA多克隆抗体。进一步地，所述荧光微球为铕荧光微球。进一步地，所述吸水纸、硝酸纤维素膜、标记垫、样品垫依次粘附在所述背板上。本专利技术提供了上述甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条的制备方法，所述方法包括以下步骤：S1：荧光微球的处理取质量浓度0.8-1.2％荧光微球150-250微升，在转速为10000-13000rpm离心10-20分钟，弃去上清；加入初洗缓冲液0.8-1.2毫升，超声混匀，洗涤2-4次后，最后一次加入初洗缓冲液0.8-1.2毫升；加入8-12毫克碳化二亚胺搅拌3-8分钟，超声；然后加入16-24毫克N-羟基琥珀酰亚胺反应10-15分钟；反应完成后，在转速为10000-13000rpm离心，弃去上清，加入偶联缓冲液0.8-1.2毫升，超声混匀，洗涤2-4次后，最后一次加入偶联缓冲液0.4-0.6毫升，超声重悬；所述初洗缓冲液为摩尔浓度20-100mM的MES缓冲液，pH值为5.0-8.5；所述偶联缓冲液为摩尔浓度20-100mM的MES缓冲液，pH值为5.0-8.5；S2：抗人IgA抗体-荧光微球的制备将0.4-0.6毫克抗人IgA抗体加入到0.4-0.6毫升偶联缓冲液中，然后将步骤S1处理后的荧光微球加入到抗人IgA抗体溶液中避光搅拌反应1.5-2.5小时；加入0.4-0.6毫升封闭缓冲液封闭搅拌40-80分钟；将溶液超声，在转速为10000-13000rpm离心8-12分钟，弃去上清；加入终洗缓冲液，超声混匀，洗涤2-4次后，加入160-240微升终洗缓冲液重悬，制得抗人IgA抗体-荧光微球；所述封闭缓冲液包括磷酸盐缓冲液、BSA、乙醇铵，其中磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为5-50mM，BSA的质量浓度为0.4-6％，乙醇铵的质量浓度为0.8-1.2％，pH值为6.8-7.5；所述终洗缓冲液包括磷酸盐缓冲液、BSA、吐温20，其中磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为5-50mM，BSA的质量浓度为0.4-6％，吐温20的质量浓度为0.08-0.12％，pH值为6.8-7.5；S3：抗人IgA抗体-荧光微球标记物结合标记垫的制备将玻璃纤维用处理液浸泡50-70分钟，取出吸干、干燥10-14小时；将所述步骤S2制备好的抗人IgA抗体-荧光微球，用微球稀释液稀释5-7倍后均匀喷涂在标记垫上，每1厘米喷涂3-5微升抗人IgA抗体-荧光微球溶液；喷涂好的标记物垫在湿度15％、温度37℃条件下烘干处理24小时；所述玻璃纤维用处理液包括PB缓冲液、EDTA-2Na，其中PB缓冲液的摩尔浓度为16-24mM，EDTA-2Na的质量浓度为0.8-1.2％；所述微球稀释液包括Tris缓冲液、PVP和海藻糖，其中Tris缓冲液的摩尔浓度为40-60mM，PVP的质量浓度为0.4-0.6％，海藻糖的质量浓度为4-6％，pH值为7.7-8.3；S4：硝酸纤维素膜包被用包被液稀释人IgA抗体、甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段，其中人IgA抗体的浓度为1.2-1.8mg/ml，甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段浓度为0.8-1.2mg/ml；将人IgA抗体喷到硝酸纤维素膜上对照线，将甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段喷到硝酸纤维素膜上检测线；将喷涂好的硝酸纤维素膜放置在湿度10-30％，温度20-35℃条件下烘干处理12小时以上；所述包被液由PB缓冲液和蔗糖组成，其中PB缓冲液的摩尔浓度为8-12mM，蔗糖的质量浓度为0.8-1.2％，pH值为7.1-7.7；S5：组装、切条将吸水纸、硝酸纤维素膜、标记垫、样品垫按顺序黏贴在背板上，然后调整切条机参数进行切条，制得甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条。本专利技术还提供另一种甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条包括背板、样品垫、标记垫、硝酸纤维素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条，其特征在于：包括背板、样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述硝酸纤维素膜包括甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段的检测线和人IgA的抗体对照线；所述标记垫设有抗人IgA抗体‑荧光微球标记物。

【技术特征摘要】
1.一种甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条，其特征在于：包括背板、样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述硝酸纤维素膜包括甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段的检测线和人IgA的抗体对照线；所述标记垫设有抗人IgA抗体-荧光微球标记物。2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条，其特征在于：所述甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段的氨基酸序列如序列表SeqIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条，其特征在于：所述抗人IgA抗体选自羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体或兔抗人IgA多克隆抗体；和/或，所述荧光微球为铕荧光微球。4.权利要求1-3中任一项所述的甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：荧光微球的处理取质量浓度0.8-1.2％荧光微球150-250微升，在转速为10000-13000rpm离心10-20分钟，弃去上清；加入初洗缓冲液0.8-1.2毫升，超声混匀，洗涤2-4次后，最后一次加入初洗缓冲液0.8-1.2毫升；加入8-12毫克碳化二亚胺搅拌3-8分钟，超声；然后加入16-24毫克N-羟基琥珀酰亚胺反应10-15分钟；反应完成后，在转速为10000-13000rpm离心，弃去上清，加入偶联缓冲液0.8-1.2毫升，超声混匀，洗涤2-4次后，最后一次加入偶联缓冲液0.4-0.6毫升，超声重悬；所述初洗缓冲液为摩尔浓度20-100mM的MES缓冲液，pH值为5.0-8.5；所述偶联缓冲液为摩尔浓度20-100mM的MES缓冲液，pH值为5.0-8.5；S2：抗人IgA抗体-荧光微球的制备将0.4-0.6毫克抗人IgA抗体加入到0.4-0.6毫升偶联缓冲液中，然后将步骤S1处理后的荧光微球加入到抗人IgA抗体溶液中避光搅拌反应1.5-2.5小时；加入0.4-0.6毫升封闭缓冲液封闭搅拌40-80分钟；将溶液超声，在转速为10000-13000rpm离心8-12分钟，弃去上清；加入终洗缓冲液，超声混匀，洗涤2-4次后，加入160-240微升终洗缓冲液重悬，制得抗人IgA抗体-荧光微球；所述封闭缓冲液包括磷酸盐缓冲液、BSA、乙醇铵，其中磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为5-50mM，BSA的质量浓度为0.4-6％，乙醇铵的质量浓度为0.8-1.2％，pH值为6.8-7.5；所述终洗缓冲液包括磷酸盐缓冲液、BSA、吐温20，其中磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为5-50mM，BSA的质量浓度为0.4-6％，吐温20的质量浓度为0.08-0.12％，pH值为6.8-7.5；S3：抗人IgA抗体-荧光微球标记物结合标记垫的制备将玻璃纤维用处理液浸泡50-70分钟，取出吸干、干燥10-14小时；将所述步骤S2制备好的抗人IgA抗体-荧光微球，用微球稀释液稀释5-7倍后均匀喷涂在标记垫上，每1厘米喷涂3-5微升抗人IgA抗体-荧光微球溶液；喷涂好的标记物垫在湿度15％、温度37℃条件下烘干处理24小时；所述玻璃纤维用处理液包括PB缓冲液、EDTA-2Na，其中PB缓冲液的摩尔浓度为16-24mM，EDTA-2Na的质量浓度为0.8-1.2％；所述微球稀释液包括Tris缓冲液、PVP和海藻糖，其中Tris缓冲液的摩尔浓度为40-60mM，PVP的质量浓度为0.4-0.6％，海藻糖的质量浓度为4-6％，pH值为7.7-8.3；S4：硝酸纤维素膜包被用包被液稀释人IgA抗体、甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段，其中人IgA抗体的浓度为1.2-1.8mg/ml，甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段浓度为0.8-1.2mg/ml；将人IgA抗体喷到硝酸纤维素膜上对照线，将甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段喷到硝酸纤维素膜上检测线；将喷涂好的硝酸纤维素膜放置在湿度10-30％，温度20-35℃条件下烘干处理12小时以上；所述包被液由PB缓冲液和蔗糖组成，其中PB缓冲液的摩尔浓度为8-12mM，蔗糖的质量浓度为0.8-1.2％，pH值为7.1-7.7；S5：组装、切条将吸水纸、硝酸纤维素膜、标记垫、样品垫按顺序黏贴在背板上，然后调整切条机参数进行切条，制得甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条。5.一种甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条，其特征在于：包括背板、样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述硝酸纤维素膜包括抗人IgA抗体的检测线和甲型流感病毒NP蛋白抗体的对照线，所述标记垫设有甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段-荧光微球标记物。6.根据权利要求5所述的甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条，其特征在于：所述甲型流感病毒NP蛋白抗原多肽片段的氨基酸序列如序列表SeqIDNO.1所示；和/或，所述荧光微球为铕荧光微球。7.根据权利要求5所述的甲型流感病毒IgA抗体免疫荧光检测试纸条，其特征在于：所述抗人IgA抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：游爱萍，李有生，刘辉，刘轶锴，
申请(专利权)人：广州瑞辉生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44