一种定量检测VBNC状态细菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种定量检测VBNC状态细菌的方法。本发明专利技术的方法包括如下步骤：PMA处理HPCD诱导的VBNC状态的E.coli O157:H7，消除样品中死菌和受损细菌对定量的影响；以PMA处理后的VBNC状态细菌的基因组DNA为模板进行ddPCR，建立了快速定量检测VBNC状态细菌数量的PMA‑ddPCR检测方法。本发明专利技术的检测方法可以在4‑6h内实现对VBNC状态细菌的准确检出及定量，检测范围为101‑107，定量范围为102‑107，该方法不仅特异性强和灵敏度高，且定量准确、结果可靠、简洁省时，无论是对食品中VBNC状态细菌的检测和定量，还是对食品安全的管理和监控都具有很重要的意义。

A method for quantitative detection of VBNC state bacteria

The invention discloses a method for quantitatively detecting bacteria in VBNC state. The method of the present invention includes the following steps: PMA treatment of the E.coli O157:H7 of VBNC state induced by HPCD to eliminate the quantitative influence of dead and damaged bacteria in the samples; ddPCR with the genomic DNA of VBNC state bacteria treated by PMA as a template, and a PMA ddPCR detection method for rapid quantitative detection of the number of VBNC like bacteria is established. The detection method of the invention can detect and quantify the bacteria of VBNC state in 4 6h. The detection range is 101 and 107, and the quantitative range is 102 107. The method is not only specific and sensitive, but also accurate, reliable, concise and time-saving, no matter the detection and quantification of VBNC state bacteria in food, It is very important for food safety management and monitoring.

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测VBNC状态细菌的方法
本专利技术涉及食品安全及生物检测
，尤其涉及食品中定量检测VBNC状态细菌的方法，特别涉及定量检测VBNC状态Escherichia.coliO157:H7的方法。
技术介绍
在外界的不利环境下，很多细菌会进入一种活的非可培养(viablebutnonculturable，VBNC)状态。该状态是非芽孢细菌的一种休眠形式，可以提高细菌在不利环境下的存活能力。目前已知80多种细菌都能进入活的非可培养状态，其中绝大部分为致病菌。虽然VBNC细菌仍然具有代谢活性，但在该菌常用的非选择性培养基上不能生长或形成菌落，常规细菌检测方法如平板计数法检测不到VBNC细菌的存在，这样就可能低估检测样品中细菌的数量，给人们带来安全隐患。因此，开发有关VBNC状态细菌的检测方法对有效杀灭VBNC细菌至关重要。活的非可培养状态的判定标准为可培养菌数为零但活菌数不为零，其中活菌数的确定是判断不可培养细菌是死亡还是进入VBNC状态的关键。目前，最为常见的VBNC状态检测方法为①检测细胞结构(如细胞膜)的完整性。这种方法是依靠荧光染料来区分死活菌，主要是利用一些荧光染料对细胞膜的透性不同这一特征。有些荧光染料能透过完整的及受损的细胞膜，如SYTO9、SYBR-GreenⅠ，而有些荧光染料仅能通过受损的细胞膜，如EB、PI等。将具有不同细胞膜透性能力的染料相结合就可以区分出死菌与活菌，再结合流式细胞仪的检测就能得出活菌的数量。目前最为常用的为Live/DeadBaclight试剂盒。②PMA结合RT-PCR(Real-timePCR)检测VBNC细菌特定基因的表达情况。叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide，PMA)是一种具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料，可通过破损的细胞膜进入胞内，与DNA发生不可逆的共价结合，阻止死细胞或受损细胞的DNA被扩增。因此，能被扩增的即可认为是VBNC菌。但是以上方法存在一定的缺陷，流式细胞仪对VBNC细菌计数是通过对照活菌以及完全致死的菌在流式细胞仪数据图上的分布区域来界定处理样品组VBNC的百分比，该方法只能得到VBNC细菌较为粗略的百分比数量；而PMA结合RT-PCR方法的主要短板在于RT-PCR实验成功实施的前提是需要确定引物的扩增效率，且很大程度上依赖于Ct值，重复性差，易造成实验误差，难以做到准确定量。随着PCR仪器的不断更新，微滴数字PCR方法(DropletdigitalPCR，ddPCR)已成为近年来发展起来的快速、准确、可实现DNA绝对定量的PCR技术。其原理是通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布在一定数目的微滴中，使大部分微滴中的DNA分子数目为1或0，然后通过PCR扩增和荧光信号的累计读取来确定阳性微滴数目，再根据泊松分布计算出样本中的DNA分子数。数字PCR的定量方法不再依赖于扩增曲线的循环阈值，因此受扩增效率的影响非常小，也不必采用内参和标准曲线，具有很好的重复性和准确度，可以实现样品的绝对定量分析。目前，已有将ddPCR应用于沙门氏菌、E.coliO157:H7、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌等食源性致病菌的检测中。然而，在该方法的检测中，存在较大问题，细菌经诱导进入VBNC状态后，体系中不仅存在仍具有活性的VBNC菌，同时也存在死菌或受损的菌，提取基因组并进行扩增后并不能区分死/活菌。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种定量检测VBNC状态细菌的方法。本专利技术提供的定量检测VBNC状态细菌的方法包括如下步骤：1)用叠氮溴化丙锭处理待测VBNC状态细菌，得到叠氮溴化丙锭处理后细菌；2)以所述叠氮溴化丙锭处理后细菌的基因组DNA为模板，对所述待测VBNC状态细菌中的靶标基因进行ddPCR扩增，得到靶标基因的拷贝数；3)根据所述靶标基因的拷贝数确定待测VBNC状态细菌的数量。上述方法中，所述用叠氮溴化丙锭处理待测VBNC状态细菌的方法包括如下步骤：将待测VBNC状态细菌的菌液与叠氮溴化丙锭混匀，孵育，得到孵育产物；将所述孵育产物进行光照处理，得到所述叠氮溴化丙锭处理后细菌。由于叠氮溴化丙锭(PMA)可结合死菌或者受损菌的DNA，使其发生不可逆的修饰从而不能被扩增，而叠氮溴化丙锭不能进入细胞膜完整的菌，即VBNC状态细菌的基因组DNA可正常扩增。本专利技术利用叠氮溴化丙锭处理待测VBNC状态细菌或待测样品来区分VBNC状态细菌及死菌或受损伤的菌，随后通过ddPCR对VBNC状态细菌实现绝对定量计数。上述方法中，所述待测VBNC状态细菌与所述叠氮溴化丙锭的配比为1×107CFU:(15-23)μg，优选地，所述待测VBNC状态细菌与所述叠氮溴化丙锭的配比为1×107CFU:20μg。上述方法中，所述孵育的条件为30℃孵育15-30min，具体地，所述孵育的条件为30℃孵育30min。上述方法中，所述光照处理的方法为将孵育产物在距离500W卤素灯20cm处光照10-20min，具体地，所述光照处理的方法为将孵育产物在距离500W卤素灯20cm处光照15min。上述方法中，所述细菌可为现有技术中任一种细菌，如大肠杆菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌、结核分枝杆菌、鼠伤寒沙门菌、单核细胞增生李斯特菌等。具体地，具体所述细菌为大肠杆菌，在本专利技术中，所述大肠杆菌为E.coliO157:H7。上述方法中，所述靶标基因可为rfbe基因。所述rfbe基因在大肠杆菌中为单拷贝，所以rfbe基因的拷贝数直接等同于细菌细胞的个数，根据rfbe基因的拷贝数即可推算出菌体中的细菌数量。在实际应用中，在检测VBNC状态大肠杆菌E.coliO157:H7，或检测其他VBNC状态大肠杆菌或细菌时，可选择其他靶标基因进行ddPCR扩增，优选地，选择单拷贝靶标基因，根据靶标基因拷贝数即可直接推算出菌体中的细菌数量。上述方法中，所述ddPCR扩增所使用的引物对由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成。上述方法中，所述引物对中的各条引物在ddPCR扩增反应体系中的终浓度均为500nmol/L；所述ddPCR扩增的退火温度为60℃。具体地，所述ddPCR反应体系如下：2×PCR混合液(Bio-Rad)10μl、序列1所示的正向引物1μl、序列2所示的反向引物1μl、DNA模板1μl、H2O7μl。所述ddPCR反应程序如下：95℃/5min；95℃/30s，60℃/60s，40个循环；4℃5min，95℃10min，升降温2.0℃/s。本专利技术的第二个目的是提供上述方法的新用途。本专利技术提供了上述方法在定量检测待测样品中VBNC状态细菌中的应用。本专利技术提供了上述方法在定量检测待测样品中活菌中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种定量检测待测样品中VBNC状态细菌的方法。本专利技术提供的定量检测待测样品中VBNC状态细菌的方法包括如下步骤：1)用叠氮溴化丙锭处理待测样品，得到叠氮溴化丙锭处理后样品；2)以所述叠氮溴化丙锭处理后样品的基因组DNA为模板，对所述待测样品中VBNC状态细菌中的靶标基因进行ddPCR扩增，得到靶标基因的拷贝数；3)根据所述靶标基因的拷贝数确定待测样品中VBNC状态细菌的数量。上述方法中，所述用叠氮溴化丙锭处理待测样品的方法包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测VBNC状态细菌的方法，包括如下步骤：1)用叠氮溴化丙锭处理待测VBNC状态细菌，得到叠氮溴化丙锭处理后细菌；2)以所述叠氮溴化丙锭处理后细菌的基因组DNA为模板，对所述待测VBNC状态细菌中的靶标基因进行ddPCR扩增，得到靶标基因的拷贝数；3)根据所述靶标基因的拷贝数确定待测VBNC状态细菌的数量。

【技术特征摘要】
1.一种定量检测VBNC状态细菌的方法，包括如下步骤：1)用叠氮溴化丙锭处理待测VBNC状态细菌，得到叠氮溴化丙锭处理后细菌；2)以所述叠氮溴化丙锭处理后细菌的基因组DNA为模板，对所述待测VBNC状态细菌中的靶标基因进行ddPCR扩增，得到靶标基因的拷贝数；3)根据所述靶标基因的拷贝数确定待测VBNC状态细菌的数量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述用叠氮溴化丙锭处理待测VBNC状态细菌的方法包括如下步骤：将待测VBNC状态细菌的菌液与叠氮溴化丙锭混匀，孵育，得到孵育产物；将所述孵育产物进行光照处理，得到所述叠氮溴化丙锭处理后细菌；或，所述待测VBNC状态细菌与所述叠氮溴化丙锭的配比为1×107CFU:(15-23)μg；或，所述孵育的条件为30℃孵育15-30min；或，所述光照处理的方法为将孵育产物在距离500W卤素灯20cm处光照10-20min。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌；或，所述大肠杆菌为E.coliO157:H7；或，所述靶标基因为rfbe基因。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述ddPCR扩增所使用的引物对由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；或，所述引物对中的各条引物在ddPCR扩增反应体系中的终浓度均为500nmol/L；或，所述ddPCR扩增的退火温度为60℃。5.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖小军，董开，潘寒姁，王永涛，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11