基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物传感器领域，具体涉及一种基于石墨烯的血红蛋白生物传感器电极的制备方法及其应用。将石墨烯与壳聚糖复合作为电极的修饰层，石墨烯优异的生物相容性和导电性能有助于实现血红蛋白与电极的直接电子传递，石墨烯优异的生物相容性可使团聚的血红蛋白分子在其表面铺展，使其电活性部分血红素暴露出来，实现血红蛋白与电极的直接电子转移，即实现血红蛋白的直接检测。本发明专利技术制备的血红蛋白生物传感器，采用石墨烯材料既利于血红蛋白的吸附与铺展又能实现其与电极直接电子传递，生物传感器灵敏度高，稳定性好，线性范围宽，具有较强的抗干扰能力，可广泛地用于疑似胃肠道恶性肿瘤病人的便潜血筛查。

Preparation and application of graphene based electrode for hemoglobin sensor

The invention belongs to the field of biosensors, in particular to a preparation method of a hemoglobin biosensor electrode based on graphene and its application. The excellent biocompatibility and conductive properties of graphene are helpful to the direct electron transfer of hemoglobin and electrode. The excellent biocompatibility of graphene can spread the hemoglobin molecules on its surface to expose the electroactive part of the hemoglobin. The direct electron transfer between hemoglobin and electrode is realized, that is, direct detection of hemoglobin. The hemoglobin biosensor prepared by the invention can be used not only for the adsorption and spreading of hemoglobin, but also for the direct electron transfer with the electrode. The biosensor has high sensitivity, good stability, wide linear range and strong anti-interference ability, and can be widely used in suspected gastrointestinal malignant tumor disease. Human occult blood screening.

【技术实现步骤摘要】
基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法及其应用
本专利技术属于生物传感器领域，具体涉及一种基于石墨烯的血红蛋白生物传感器电极的制备方法及其应用。
技术介绍
大肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤，占全部胃肠道癌的首位，目前其发病率有逐年增高趋势。根据国家肿瘤登记中心报道，1991年至2005年结直肠癌发病率是上升速度最快的三种肿瘤之一。在西方社会的发病率更高，据近年统计每20位成年人中便有一例大肠癌患者。国外数据显示，开展结直肠癌筛查可以发现癌前疾病，经过适当的干预，有效降低肿瘤的发病率和病死率。虽然诊断技术不断发展，但由于大肠癌的早期症状易被忽略，故很多患者在确诊时已经偏晚，严重影响预后，因此积极提高大肠癌的早期诊断率已是当务之急。粪便隐血诊断是筛查早期大肠癌患者的重要手段之一。隐血一般是指消化道出血量很少肉眼看不见的血色，而其少量红细胞又被分解消化以致镜下也无从发现的出血状况而言。粪便隐血检查对消化道出血的诊断有重要价值，在消化道溃疡时阳性率约为40％～70％呈间断性阳性。消化道癌肿时阳性率可达95％，呈持续性阳性，故粪便隐血检验已被用作消化道恶性肿瘤的诊断筛选指标。目前，常用的化学法隐血试验的原理为血红蛋白中的含铁血红素部分，该种蛋白有类似过氧化物酶作用，能催化试剂中的过氧化氢分解，释放新生态氧，新生态氧可氧化各种色原物质(如：邻联甲苯胺、匹拉米洞、愈创木酯等)而呈色。色调深浅与血红蛋白的多少，出血量的大小成正比，其中邻联甲苯胺法是最常用。化学法隐血试验虽简易可行，但特异性、准确性均差。为了解决上述问题，近年来建立了多种免疫学方法来助诊消化道出血及筛查早期大肠癌。虽然免疫学方法使血红蛋白的检出率比化学法可提高一倍以上，但通常给出的结果是定性的结果，而非定量值，且当血红蛋白高过某一极限值时还会给出假阴性结果，造成严重的漏检结果，以至延误病情。因此，目前迫切需要一种快速、准确、定量、简便的方法来检验便隐血，电化学检验血红蛋白的方法就可以满足这一要求。众所周知血红蛋白(Hb)是脊椎动物红细胞内的呼吸蛋白，是血液中运输氧气的主要物质，是由两条α和两条β多肽链构成的四聚体，每个肽链上各结合有一个血红素分子，且相互接近，形成近似球形的血红蛋白分子，直径为55nm。血红素位于肽链折叠形成的介电常数较低的疏水环境中，铁离子以共价键形式与卟啉的四个吡咯环中的N原子以及肽链中的组氨酸相连接。综上所述，由于血红蛋白分子的空间结构庞大，电活性中心不容易暴露，而且易于吸附在电极表面而使固体电极表面钝化，同时其过电位较高，在电极上电子转移速率很慢，难以得到有效的电化学信号，且其相对分子质量较大，在溶液中的浓度通常较低，产生的氧化还原电流较小，其电信号易被充电电流、残余电流等背景电流所掩盖，如在玻碳电极上就无明显的电化学信号，所以早期以各种裸电极对其进行研究和测定并不成功。为了改善血红蛋白电极反应的可逆性，加速其在电极上交换电子的速率，活化其氧化还原中心，有人采用各种促进剂来加快血红蛋白的电极反应过程。促进剂是一类非电活性的物质，其本身在电极上并无反应，但易于吸附在电极表面，它的存在可以加速血红蛋白在电极上交换电子的速度。原因可能是表面活性剂与血红蛋白相互作用形成复合物而使Hb的多肽链伸展开来，其疏水结构被打开使电活性中心暴露而加快了电子转移的速率。更多的报道是以各种染料作为媒介体的修饰电极对Hb的电化学性质进行的研究。许多种染料被用做媒介体来对血红蛋白进行研究，它们主要起到电极与血红蛋白之间传递电子的作用。但这些研究多集中在血液中血红蛋白的浓度检验，用于检查与血红蛋白浓度相关的疾病，而没有人提出采用电化学检验血红蛋白浓度的方法来检验便隐血。电化学测试方法方便快捷，且能给出定量的结果。但是便隐血的浓度通常较低，用肉眼是难于观察到的，所以需要一个富集再直接电化学测定的过程。近年来出现的新兴碳材料石墨烯具有独特的结构和优异的性能，它具有非常高的机械强度、大的比表面积以及极强的电子传输能力，且成本低廉，可加工性好；对于待测物质具有一定的电催化作用，可以实现良好的重现性和可再生性。石墨烯大的比表面积对血红蛋白具有富集作用，而石墨烯的生物相容性使血红蛋白在其表面将多肽链伸展开来，疏水结构被打开使电活性中心暴露而加快了电子转移的速率，因此实现了血红蛋白与电极的直接电子转移。综上所述，石墨烯的高导电性和高电子传导速率可以实现血红蛋白的活性中心的直接电子传递，石墨烯修饰电极有望用于便隐血的检验。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于石墨烯的第三代血红蛋白传感器电极的制备方法及其应用，采用石墨烯材料既利于血红蛋白的吸附与铺展又能实现其与电极直接电子传递，生物传感器灵敏度高，稳定性好，线性范围宽，具有较强的抗干扰能力，可广泛地用于疑似胃肠道恶性肿瘤病人的便潜血筛查。本专利技术的技术方案是：一种基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，包括如下步骤：(1)石墨烯修饰电极的制备将化学氧化法制备的氧化石墨烯分散于磷酸盐缓冲溶液中形成稳定的分散液，将该分散液滴涂到经清洁后的玻碳电极上，氧化石墨烯修饰过的电极在室温下干燥；(2)修饰电极上氧化石墨烯的还原将步骤(1)制得的修饰电极作为工作电极放入摩尔浓度为0.05～0.2M磷酸盐缓冲溶液溶液中，与饱和甘汞参比电极和铂片对电极构成三电极体系，在电化学工作站上在-1.5～0V电压范围内做循环伏安扫描，使氧化石墨烯还原成石墨烯，从而进一步提高电极的导电性及对血红蛋白的吸附性能，促进血红蛋白与电极的直接电化学反应。所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，步骤(1)中，为了提高修饰电极的稳定性，再滴涂壳聚糖溶液即得到所要制备的修饰电极。所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，壳聚糖溶液采用浓度为0.1～0.5wt％的壳聚糖醋酸溶液。所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，步骤(1)中，氧化石墨烯在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.05mg/ml～5mg/ml，修饰电极所用氧化石墨烯溶液的量为0.5～20μl。所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，优选的，步骤(1)中，氧化石墨烯在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.5～3mg/ml，修饰电极所用氧化石墨烯溶液的量为2～15μl。所述方法制备的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的应用，血红蛋白生物传感器电极用于检测血红蛋白，检测粪便中的血红蛋白，检测尿中的血红蛋白。所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的应用，石墨烯修饰电极传感器对血红蛋白溶液浓度的检测过程如下：将修饰电极与银/氯化银电极和铂片电极构成三电极体系，在摩尔浓度为0.05～0.1M的H2SO4溶液中加入血红蛋白构成电解液，在电化学工作站上在-0.65～0.4V电压范围内做循环伏安CV扫描，在CV曲线上的氧化还原峰电流随血红蛋白浓度呈规律性变化，从而实现对血红蛋白浓度的测试。本专利技术的设计思想是：本专利技术将石墨烯与壳聚糖复合作为电极的修饰层，石墨烯优异的生物相容性和导电性能有助于实现血红蛋白与电极的直接电子传递，石墨烯优异的生物相容性可使团聚的血红蛋白分子在其表面铺展，使其电活性部分血红素暴露出来，实现血红蛋白与电极的直接电子转移，即实现血红蛋白的直接检测。以上述的石墨烯修饰电极为工作电极，银/氯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，其特征是，包括如下步骤：(1)石墨烯修饰电极的制备将化学氧化法制备的氧化石墨烯分散于磷酸盐缓冲溶液中形成稳定的分散液，将该分散液滴涂到经清洁后的玻碳电极上，氧化石墨烯修饰过的电极在室温下干燥；(2)修饰电极上氧化石墨烯的还原将步骤(1)制得的修饰电极作为工作电极放入摩尔浓度为0.05～0.2M磷酸盐缓冲溶液溶液中，与饱和甘汞参比电极和铂片对电极构成三电极体系，在电化学工作站上在‑1.5～0V电压范围内做循环伏安扫描，使氧化石墨烯还原成石墨烯，从而进一步提高电极的导电性及对血红蛋白的吸附性能，促进血红蛋白与电极的直接电化学反应。

【技术特征摘要】
1.一种基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，其特征是，包括如下步骤：(1)石墨烯修饰电极的制备将化学氧化法制备的氧化石墨烯分散于磷酸盐缓冲溶液中形成稳定的分散液，将该分散液滴涂到经清洁后的玻碳电极上，氧化石墨烯修饰过的电极在室温下干燥；(2)修饰电极上氧化石墨烯的还原将步骤(1)制得的修饰电极作为工作电极放入摩尔浓度为0.05～0.2M磷酸盐缓冲溶液溶液中，与饱和甘汞参比电极和铂片对电极构成三电极体系，在电化学工作站上在-1.5～0V电压范围内做循环伏安扫描，使氧化石墨烯还原成石墨烯，从而进一步提高电极的导电性及对血红蛋白的吸附性能，促进血红蛋白与电极的直接电化学反应。2.根据权利要求1所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，为了提高修饰电极的稳定性，再滴涂壳聚糖溶液即得到所要制备的修饰电极。3.根据权利要求2所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制备方法，其特征在于，壳聚糖溶液采用浓度为0.1～0.5wt％的壳聚糖醋酸溶液。4.根据权利要求1所述的基于石墨烯的血红蛋白传感器电极的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：英哲，张睿，杨卫东，郝亚斌，孙宝明，宋纯，李记彬，曾尤，成会明，
申请(专利权)人：中国科学院金属研究所，辽宁省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21