一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测法制造技术

本发明专利技术涉及了一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测法。本发明专利技术利用功能化的二氧化硅作为模板，通过疏水性‑疏水性作用将氧化石墨烯与之混合，冷冻，煅烧得到石墨烯泡沫，同时利用静电吸附和共价键法将活性酶固定在石墨烯泡沫(NGF)孔从而构建CYP3A4/PNGF酶反应器。发展出一种具有成本低、操作简单、方便快捷的特点的电化学分析法。本发明专利技术使用的酶反应器可调控孔径，通过安培法可以快速、准确地测定内分泌干扰物的代谢行为，方法灵敏度高、稳定性好，适宜推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测法
本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测法。
技术介绍
内分泌干扰物(endocrinedisruptingchemicals,EDCs)是指能够介入生物体内荷尔蒙的合成、分泌、输送、结合、作用或分解，从而影响生物体的正常性维持，危害生殖、发育或行为的外源性化学物质。EDCs普遍存在于农药、化妆品、塑料、食品、药品等中，常见的有双酚A(BPA)、邻苯二甲酸酯、烷基酚类、多氯联苯(PCBs)等。因而建立一种成本低、操作简单、方便快捷的检测内分泌干扰物的方法显得尤为重要。大量研究表明CYP450S酶可能会激活某些EDCs，使其代谢产物与体内受体、蛋白酶等生物大分子具有更强的结合力。常用的体外CYP450的体外温孵法主要有肝微粒体体外温孵法、重组CYP450酶体外温孵法、肝细胞体外温孵法等，主要是将一定量的CYP底物和制备好的肝微粒体或重组CYP450S酶或肝细胞在模拟生理环境下温孵。在所有基于CYP450S酶的体外代谢法中，不管是实验室方法还是工业方法，都需要电子供体辅酶NADPH的参与，NADPH价格昂贵、不易保存，来源极不经济。为解决这一问题，人们开始利用电化学手段进行对CYP450s的体外研究。但研究发现如果直接将酶蛋白质固定在电极表面，易导致酶蛋白质的吸附变形，因此其直接电化学是不容易实现的。为解决这一问题，人们一般采用纳米复合材料修饰电极的方法来维持酶蛋白质的生物活性。Gilardi等人将CYP融合CPR形成的蛋白，通过控制CYP的活性呋喃氧基氧化剂的存活时间来增强催化活性。Mie等人设计了具有疏水单元的硫醇化金电极，用来固定重组CYP450s，并证明了其电催化性能。Rusling等人将纯化的CYP450S酶和CPR通过层层组装在PG电极表面构建了PDDA/PSS(CYP450S1A2/CPR+b5)6多层膜，由电极能够先将电子传递给CPR，通过CPR再将电子传递给CYP450S酶血红素中心，这种电子传递过程与实际体内相一致。但是，这些工作都普遍存在底物催化产率低、响应信号微弱的现象。造成以上现象的原因，一方面是由于固定界面不利于固定化酶构象的保持；另一方面是由于固定界面不利于酶活性中心从电极获取催化反应需要的两个电子。因此，构建具有良好生物相容性、优异电子传递性的固定界面，对于构建高催化效率、高灵敏度的活性酶电化学反应器具有重要意义。目前，基于构建酶反应器用于内分泌干扰物的检测越来越受到关注。Tang等人制备TiO2/CdSe@CdS/葡萄糖氧化酶构建了一种光电化学生物传感器来用于葡萄糖的测定，Li等人合成光敏TNA材料来测定H2O2含量，Liu等人采用大孔硅泡沫来测定睾酮等等。这种方法同时实现了酶纳米反应器的构建和目标物的传感，简化了操作步骤，并且具有较好的选择性和灵敏度。现有技术未公开基于制备酶纳米反应器的电化学分析法检测内分泌干扰物的技术方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于模板法制成的酶纳米反应器用于检测内分泌干扰物的简单、廉价、有效、快速的电化学检测方法。所述方法利用尺寸可控的石墨烯泡沫作为酶纳米反应器，并且使用活性酶作为内分泌干扰物代谢的催化剂本专利技术在解决上述技术问题所采用的技术方案如下：一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测方法，所述方法具体包括如下步骤：(1)以不同粒径功能化的二氧化硅作为模板，通过疏水性-疏水性作用将其与氧化石墨烯混合:首先将氧化石墨粉末分散到水中并超声4h，再在3000rmp条件下离心30min得到浓度为0.5mg/mL-1mg/mL的氧化石墨烯水溶液，然后按照体积比1:3比例将功能化的二氧化硅和氧化石墨烯水溶液在室温下混合12h得到复合材料；(2)向步骤(1)中得到的复合材料进行-20℃冻干、冷冻干燥，然后在惰性气体中煅烧，再用5wt％的氢氟酸洗，得到石墨烯泡沫；(3)向步骤(2)中得到的石墨烯泡沫用水分散，通过加入浓度为1mg/mL的盐酸多巴胺溶液对石墨烯泡沫进行功能化修饰：按照体积比为20：1的比例往盐酸多巴胺溶液中加入石墨烯泡沫得到浓度为0.5mg/mL的PNGF纳米复合材料；(4)取一定量步骤(3)中得到的PNGF纳米复合材料，并将其作为酶纳米反应器放入离心管中，再往里加入活性酶，并在振荡器上混匀，滴在玻碳电极上待用；利用三电极体系即珀丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，玻碳电极为工作电极，浓度为0.1M、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液作为电解液，通过计时-电流法每次往电解液中加入内分泌干扰物，用于检测内分泌干扰物。所述步骤(1)中所述的功能化的二氧化硅的合成方法为：先通过溶胶种子法合成二氧化硅小球；然后用DMDMS作为改性剂，盐酸作为催化剂，按照体积比1:100的比例将改性剂和盐酸加入到稀释液中，即15M盐酸、0.6g聚醚F108、0.875mLDMDMS分别添加到75mL浓度为1mg/mL的二氧化硅小球的水溶液中得到甲基化二氧化硅溶液，再氨水中和甲基化二氧化硅溶液，制得步骤(1)中所述的功能化的二氧化硅。溶胶种子法合成不同粒径的二氧化硅小球即利用起始单分散性胶粒作为种子，再通过物理或化学的方法提供二氧化硅，在种子上同步生长，从而得到单分散性的二氧化硅。所述内分泌干扰物为硝苯地平或者睾酮或者雌酮或者孕酮。所述步骤(1)中功能化的二氧化硅的孔径为60-250nm，优选为60nm。所述步骤(2)中的惰性气体为氩气。所述步骤(3)中的盐酸多巴胺溶液的制备方法是：将Tris-HCl缓冲溶液与多巴胺混合配制成pH值为6-9的盐酸多巴胺溶液，所述pH优选为8.5。所述步骤(3)中功能化修饰的盐酸多巴胺溶液浓度为0.5mg/mL-2mg/mL，优选0.5mg/mL。所述步骤(4)中活性酶为CYP3A4。所述步骤(4)中加入作为酶纳米反应器的PNGF纳米复合材料为10μL，待测内分泌干扰物的浓度为5mM。加入活性酶的浓度为10mg/mL，优选活性酶的量为5μL。本专利技术所述的电化学检测方法检测睾酮时睾酮的Kmapp值是110.70μM。更具体地，本专利技术所述的一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测方法，包括如下步骤：(1)以功能化的二氧化硅模板的粒径为60-250nm作为模板，通过疏水性-疏水性作用将其与氧化石墨烯混合；(2)向步骤(1)中得到的混合液进行-20℃冻干，冷冻干燥，惰性气体中煅烧，用5wt％的氢氟酸洗模板得到石墨烯泡沫；(3)向步骤(2)中得到的石墨烯泡沫用水分散，通过加入不同浓度的盐酸多巴胺溶液对石墨烯泡沫进行功能化修饰得到PNGF纳米复合材料。(4)向步骤(3)中得到的PNGF纳米复合材料，取10ul的材料作为酶纳米反应器放入A离心管中，往里加入浓度为10mg/mL的活性酶，振荡器上混匀，滴在玻碳电极上待用,用于检测浓度为5mM的内分泌干扰物。本专利技术利用不同粒径功能化的二氧化硅作为模板，通过疏水性-疏水性作用将氧化石墨烯与之混合，冷冻，煅烧得到不同孔径且大小均一的石墨烯泡沫。盐酸多巴胺是一个两性物质，在pH>4时带负电，由于盐酸多巴胺会自聚合成聚多巴胺，聚多巴胺具有超亲水性的性质，因此通过π-π作用可与石墨烯泡沫复合得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)以不同粒径功能化的二氧化硅作为模板，通过疏水性‑疏水性作用将其与氧化石墨烯混合:首先将氧化石墨粉末分散到水中并超声4h，再在3000rmp条件下离心30min得到浓度为0.5mg/mL的氧化石墨烯水溶液，然后按照体积比1:3比例将功能化的二氧化硅和氧化石墨烯水溶液在室温下混合12h得到复合材料；(2)向步骤(1)中得到的复合材料进行‑20℃冻干、冷冻干燥，然后在惰性气体中煅烧，再用5wt％的氢氟酸洗，得到石墨烯泡沫；(3)向步骤(2)中得到的石墨烯泡沫用水分散，通过加入浓度为1mg/mL的盐酸多巴胺溶液对石墨烯泡沫进行功能化修饰：按照体积比为20：1的比例往盐酸多巴胺溶液中加入石墨烯泡沫得到浓度为0.5mg/mL的PNGF纳米复合材料；(4)取一定量步骤(3)中得到的PNGF纳米复合材料，并将其作为酶纳米反应器放入离心管中，再往里加入活性酶，并在振荡器上混匀，滴在玻碳电极上待用；利用三电极体系即珀丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，玻碳电极为工作电极，浓度为0.1M、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液作为电解液，通过计时‑电流法每次往电解液中加入内分泌干扰物，用于检测内分泌干扰物。...

【技术特征摘要】
1.一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)以不同粒径功能化的二氧化硅作为模板，通过疏水性-疏水性作用将其与氧化石墨烯混合:首先将氧化石墨粉末分散到水中并超声4h，再在3000rmp条件下离心30min得到浓度为0.5mg/mL的氧化石墨烯水溶液，然后按照体积比1:3比例将功能化的二氧化硅和氧化石墨烯水溶液在室温下混合12h得到复合材料；(2)向步骤(1)中得到的复合材料进行-20℃冻干、冷冻干燥，然后在惰性气体中煅烧，再用5wt％的氢氟酸洗，得到石墨烯泡沫；(3)向步骤(2)中得到的石墨烯泡沫用水分散，通过加入浓度为1mg/mL的盐酸多巴胺溶液对石墨烯泡沫进行功能化修饰：按照体积比为20：1的比例往盐酸多巴胺溶液中加入石墨烯泡沫得到浓度为0.5mg/mL的PNGF纳米复合材料；(4)取一定量步骤(3)中得到的PNGF纳米复合材料，并将其作为酶纳米反应器放入离心管中，再往里加入活性酶，并在振荡器上混匀，滴在玻碳电极上待用；利用三电极体系即珀丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，玻碳电极为工作电极，浓度为0.1M、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液作为电解液，通过计时-电流法每次往电解液中加入内分泌干扰物，用于检测内分泌干扰物。2.根据权利要求1所述的一种基于酶纳米反应器的内分泌干扰物电化学检测法，其特征在于，所述步骤(1)中功能化的二氧化硅的孔径为60...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐璇，郑其琴，姚玥玮，姚成，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32