一种提高水稻籽粒维生素含量的方法技术

本申请公开了一种提高水稻籽粒维生素含量的方法，包括以下步骤：A.构建重组载体；B.获得转基因植株；C.收获单株自交种子；D.T1代自交留种；E.T2代自交留种；F.表型选择。所述步骤进一步包括：A.构建重组载体：从拟南芥中分离出γ‑生育酚甲基转移酶基因的cDNA片段；将它与水稻籽粒专一性谷蛋白GluB‑1启动子酶切连接到表达载体pCAMBIA1300上，构建重组载体。本发明专利技术方法提高了水稻籽粒维生素E含量，改良水稻籽粒品质，创造水稻品质改良新材料。

A method for improving the vitamin content of rice grain

The present application disclosed a method to improve the vitamin content of rice grain, including the following steps: A. construction of recombinant vector; B. obtained transgenic plants; C. harvested single plant self seed; D.T1 generation self cross seed; E.T2 generation self breeding; F. phenotypic selection. The steps included: A. construction of recombinant vector: the cDNA fragment of gamma ray tocopherol methyltransferase gene from Arabidopsis thaliana was isolated from Arabidopsis thaliana, and the recombinant vector was connected with the specific glutenin GluB promoter 1 promoter of rice grain to the expression vector pCAMBIA1300. The method improves the content of vitamin E in rice grains, improves the grain quality of rice, and creates new materials for improving rice quality.

【技术实现步骤摘要】
一种提高水稻籽粒维生素含量的方法
本专利技术涉及分子生物学植物基因工程
，特别涉及一种提高水稻籽粒维生素含量的方法。
技术介绍
维生素E是一种脂溶性的抗氧化剂，分为生育酚(α、β、γ、δ)和三烯生育酚(α、β、γ、δ)两大类，对植物生长发育具有重要的调控作用。此外，它也参与植物细胞内信号转导(Packeretal.，2001；Munne-BoschSetal.，2007)，调节基因的表达等(LandesNetal.，2003；AbateAetal.，2000)。天然维生素E主要在植物中合成，人类自身无法合成，必须从膳食特别是从植物中获取，且天然维生素E在生理活性、吸收率以及在体内保留时间和安全性上均高于人工合成的维生素E，因此提高植物天然维生素E的含量或活性具有重要的意义。水稻是我国重要粮食作物之一，其播种面积和总产量均居粮食作物首位，在我国粮食生产中具有举足轻重的地位，然而稻米中的维生素E含量很低，不足以满足人类对天然维生素E的需求。传统育种方法对于提高稻米中维生素E含量具有品种资源的局限性，而利用转基因技术改良稻米营养品质方面已有很多成功的报道，如将β-胡萝卜素合成途径中的3个基因导入水稻中使转基因水稻的胚乳中合成并积累了维生素A前体——β-胡萝卜素(BeyerPetal.，2002)。但目前除了Sookwong等利用杂交的方法来提高水稻糠层中三烯生育酚含量的研究外，还未见其他有关提高水稻维生素E含量或改变维生素E异构体组成研究的报道。拟南芥(Arabidopsisthaliana)γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是天然维生素E合成途径中的重要合成酶，催化δ、γ-生育酚甲基化，生成
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供了一种提高水稻籽粒维生素含量的方法，本专利技术方法将拟南芥(Arabidopsisthaliana)γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因的cDNA片段，用专一性谷蛋白GluB-1启动子驱动，转化水稻，使该cDNA片段在水稻籽粒中特异表达，以提高水稻籽粒维生素E含量，改良水稻籽粒品质，创造水稻品质改良新材料。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种提高水稻籽粒维生素含量的方法，包括以下步骤：A.构建重组载体；B.获得转基因植株；C.收获单株自交种子；D.T1代自交留种；E.T2代自交留种；F.表型选择。所述步骤进一步包括：A.构建重组载体：从拟南芥中分离出γ-生育酚甲基转移酶基因的cDNA片段；将它与水稻籽粒专一性谷蛋白GluB-1启动子酶切连接到表达载体pCAMBIA1300上，构建重组载体。所述步骤进一步包括：B.获得转基因植株：利用根癌农杆菌介导的转基因方法将重组载体导入水稻中，获得转基因植株。所述步骤进一步包括：C.收获单株自交种子：利用聚合酶链式反应对T0代转基因植株进行阳性检测，通过Northern杂交检测阳性转基因植株转入片段的表达，通过Southern杂交鉴定阳性转基因植株的整合拷贝数，选择含有单拷贝的转入片段，且正常结实的转基因植株，收获单株自交种子。所述步骤进一步包括：D.T1代自交留种：将步骤C选留的转基因植株的种子种成家系T1代，继续利用PCR对T1代单株进行阳性检测，利用Northern杂交方法对对阳性单株检测转入片段的表达，结合田间表现，选择多个表现优良的转基因单株，自交留种。所述步骤进一步包括：E.T2代自交留种：继续种植步骤4种选留的目标单株成T2代家系，利用PCR对T2代单株进行阳性检测，对阳性单株进行农艺形状考察和水稻种子维生素含量分析，从中选择表型稳定，维生素E含量和农艺形状有较大改善的纯合单株，自交留种。所述步骤进一步包括：F.表型选择：对选留的纯合单株进行表型选择，培育新材料。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种食品，采用如前述任一项所述提高水稻籽粒维生素含量的方法直接或间接生产而成。为解决上述技术问题，本专利技术又提供了一种如前述任一项所述提高水稻籽粒维生素含量的方法在生产用于食用或食品加工的稻米中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术另提供了一种如前述任一项所述提高水稻籽粒维生素含量的方法在建立水稻品系中的应用。本专利技术有益效果包括：A.在水稻籽粒中表达来自拟南芥γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因的cDNA片段可以提高水稻籽粒维生素E含量，从而提高了水稻籽粒营养品质，同时，单株产量也有一定提高；B.本方法采用转基因方法提高水稻籽粒品质，改良周期短，效率高；C.本方法可以直接应用于其他作物品质的改良实践；D.将拟南芥γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因的cDNA片段用水稻籽粒专一性谷蛋白GluB-1启动子驱动，转化水稻，使其cDNA在水稻籽粒中特异表达，方法易行，操作简便，提高了水稻籽粒维生素E含量，增加了单株产量，为水稻品质改良创造了新材料。本专利技术所产生的材料能直接应用于制备维生素E等医药制品，对促进人体健康以及水稻的可持续生产等具有极其重要的意义。附图说明图1为一种转化所用cDNA片段的核苷酸序列，该cDNA片段有1047个碱基组成。图2为一种T0代转基因植株阳性检测示意图：第1泳道为分子量标记，第2泳道为阳性对照(重组载体扩增结果)，第3泳道为阴性对照(野生型武育粳7号扩增结果)，第4-5泳道为空白对照，第6-18泳道为部分T0代转基因植株的扩增结果。图3为一种Northern杂交检测T0代转基因植株导入基因片段的表达量示意图：上排为rRNA，下排为各单株籽粒RNA与探针杂交结果。图4左为一种Southern杂交检测基因整合的拷贝数示意图：有3个为单拷贝转化植株。图4右为一种Southern杂交检测基因整合的拷贝数示意图：有3个为单拷贝转化植株。具体实施方式下面结合实施例详述本专利技术。为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术并不局限于这些实施例。本专利技术属于植物基因工程
更具体涉及一种提高水稻籽粒维生素含量的方法，具体包含了应用转基因方法将γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)基因的cDNA片段通过农杆菌转化水稻，使该片段在水稻籽粒中表达，以提高水稻籽粒维生素含量，创造水稻品质改良新材料。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种提高水稻籽粒维生素含量的方法，包括以下步骤：A.构建重组载体；B.获得转基因植株；C.收获单株自交种子；D.T1代自交留种；E.T2代自交留种；F.表型选择。所述步骤进一步包括：A.构建重组载体：从拟南芥中分离出γ-生育酚甲基转移酶基因的cDNA片段；将它与水稻籽粒专一性谷蛋白GluB-1启动子酶切连接到表达载体pCAMBIA1300上，构建重组载体。所述步骤进一步包括：B.获得转基因植株：利用根癌农杆菌介导的转基因方法将重组载体导入水稻中，获得转基因植株。所述步骤进一步包括：C.收获单株自交种子：利用聚合酶链式反应对T0代转基因植株进行阳性检测，通过Northern杂交检测阳性转基因植株转入片段的表达，通过Southern杂交鉴定阳性转基因植株的整合拷贝数，选择含有单拷贝的转入片段，且正常结实的转基因植株，收获单株自交种子。所述步骤进一步包括：D.T1代自交留种：将步骤C选留的转基因植株的种子种成家系T1代，继续利用PCR对T1代单株进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高水稻籽粒维生素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.构建重组载体；B.获得转基因植株；C.收获单株自交种子；D.T1代自交留种；E.T2代自交留种；F.表型选择。

【技术特征摘要】
1.一种提高水稻籽粒维生素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.构建重组载体；B.获得转基因植株；C.收获单株自交种子；D.T1代自交留种；E.T2代自交留种；F.表型选择。2.根据权利要求1所述提高水稻籽粒维生素含量的方法，其特征在于，所述步骤进一步包括：A.构建重组载体：从拟南芥中分离出γ-生育酚甲基转移酶基因的cDNA片段；将它与水稻籽粒专一性谷蛋白GluB-1启动子酶切连接到表达载体pCAMBIA1300上，构建重组载体。3.根据权利要求1所述提高水稻籽粒维生素含量的方法，其特征在于，所述步骤进一步包括：B.获得转基因植株：利用根癌农杆菌介导的转基因方法将重组载体导入水稻中，获得转基因植株。4.根据权利要求1所述提高水稻籽粒维生素含量的方法，其特征在于，所述步骤进一步包括：C.收获单株自交种子：利用聚合酶链式反应对T0代转基因植株进行阳性检测，通过Northern杂交检测阳性转基因植株转入片段的表达，通过Southern杂交鉴定阳性转基因植株的整合拷贝数，选择含有单拷贝的转入片段，且正常结实的转基因植株，收获单株自交种子。5.根据权利要求1所述提高水稻籽粒维生素含量的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国栋，刘佳音，王晶，邹丹丹，吴洁芳，张佩，修旺珊，米铁柱，
申请(专利权)人：青岛袁策生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37