一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种简便、快速的筛选、鉴定利用基因组编辑技术创建的纯合突变体的方法。该方法用于筛选与鉴定利用CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体，包括构建CRISPR/Cas9系统载体、转化植物体、利用MSBSP‑PCR筛选纯合突变体等步骤。本申请主要技术思路为：CRISPR/Cas9系统创制的突变体中，相比较于野生型的DNA，PCR反应获得少量的产物或者不能得到产物。另一方面，本申请采用的是两轮PCR，第一轮PCR的产物作为第二轮PCR的模板，可以避免基因组DNA复杂性对产物的影响，提高了PCR方法鉴定CRISPR/Cas9系统创制突变体的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种简便、快速的筛选、鉴定利用基因组编辑技术创建的纯合突变体的方法。
技术介绍
生物科学的研究进展部分程度上受限制于生物技术的发展速度，每一次生物技术的创新与突破都可能为生物科学研究的发展带来重大的突破。其中近年发展起来的基因编辑技术就具有这样的特点，这些新兴的生物技术为解读海量的基因数据提供了强大的技术支撑，并在基因工程改造、现代农业基因育种、人类疾病治疗等多个领域得到应用。基因编辑技术属于一种对基因组进行定点编辑的技术，通过将外源DNA导入到受体细胞染色体的特定位点，有目的地改造基因组、产生突变，使基因的功能发生改变，该技术已成为研究基因功能的重要手段之一。现有基因编辑技术包括锌指核酸酶技术（Zinc-fingernucleases，ZFNs）、转录激活因子效应物核酸酶技术（Trans-criptionactivatorlikeeffectornucleases，TALENs）、CRISPR/Cas（clusteredregularlyinter-spacedpalindromicrepeatsanditsassociatedproteins）系统等多种技术形式。但实际应用中，由于ZFNs和TALENs具有一定的局限性，因此，目前应用较为广泛的是CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中，由tracrRNA基因、CRISPR序列和Cas蛋白编码的基因家族组成，研究表明该系统主要起免疫防卫作用。CRISPR序列是由重复序列（Repeat）与间隔序列（Spacer）有序间隔排列而成，其中重复序列高度保守，间隔序列为免疫性获得的外源基因片段，特异识别外源DNA。Cas基因家族成员有高度的同源性，表达的蛋白具有核酸酶、解旋酶与聚合酶等作用，含有2个核酸酶结构域（氨基端的RuvC-like结构域和位于蛋白中间位置的HNH核酸酶结构域），HNH核酸酶结构域可以切割与crRNA互补配对的模板链，切割位点位于原型间隔序列毗邻基序（Protospaceradjacentmotif，PAM）上游约3个碱基处，RuvC-like结构域能对另一条链进行切割，切割位点位于PAM上游3~8个碱基。根据Cas基因核心元件序列的不同，可以将其分3种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型、Ⅱ型在细菌中普遍存在，Ⅲ型只在部分细菌中发现，Ⅰ型和Ⅲ型在古细菌中均有发现。化脓性链球菌（Streptococcuspyogenes）的Ⅱ型CRISPR-Cas系统最为简单，也是现在研究和应用最广泛的系统之一，即CRISPR-Cas9系统。该系统仅Cas9与tracrRNA：crRNA二聚体便可完成对目标基因的编辑，其它两个类型需要更多的Cas蛋白参与，才能完成其生物学功能。CRISPR/Cas9系统在动物中的研究相比植物已非常成熟，利用该系统可进行全基因组水平的基因功能筛选。CRISPR/Cas9技术首个动物实验是在斑马鱼中进行的，目前，该系统已经在多个物种中进行应用，包括：小鼠胚胎干细胞、人类多功能干细胞、果蝇、食蟹猴、家蚕、小麦、棉花、烟草、西红柿和拟南芥等。利用CRISPR/Cas9系统对目标实验对象进行基因编辑后，后续即需对突变体进行筛选。然而现有技术中对CRISPR/Cas9系统创建的突变体进行筛选时，多依赖测序工作的进行，而基因测序工作既费时又费力，而且花费颇高，因此某种程度上提高了CRISPR/Cas9系统的应用成本，限制了其推广应用范围。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种简单和快速的筛选与鉴定CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体的方法，从而为在不同物种中筛选由CRISPR/Cas9系统创建的突变体提供方法学基础，同时也可以为筛选不同物种中的点突变体的研究奠定方法学基础。本申请的主要技术思路为：针对突变位点，通过设计特异性引物，由聚合酶链式反应（mutationsitesbasedspecificprimersPCR,MSBSP-PCR）筛选与鉴定CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体。本申请所采取的技术方案详细介绍说明如下。一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，该方法的技术流程如图1所示，该方法用于筛选与鉴定利用CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体，以烟草为例，具体包括如下步骤：（1）构建CRISPR/Cas9系统载体，根据目的基因序列信息（具体例如根据NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上已公开基因序列信息），选取合适的靶点位置（PAM），利用CRISPR/Cas9系统构建针对目的基因的特异性载体；具体构建步骤如下：（1.1）设计靶位点首先，将目的基因的CDS序列与全基因组序列对比，获得目的基因的外显子和内含子序列信息；其次，设计靶位点时应把握如下原则：原则A：设计靶位点时最好在第一个外显子上设计，若第一个外显子上没有合适的位点，可以依次向后寻找；原则B：如果目的基因存在多个拷贝，则要在多个拷贝的保守区设计；原则C：寻找靶位点时，先从外显子序列上找到PAM位点，然后将PAM前面或后面的20个碱基序列放入到NEBcutterV2.0中查找酶切位点（尽量选常用的酶），酶切的位置与PAM的最好距离是3、4或5个碱基；所述PAM位点（NGG或CCN，N为任意碱基），在基因序列上的形式为：5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG-3'，或5'-CCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'；最后，登录到网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html筛选确定靶位点，确定最终靶位点时Cas9切割点（离PAM/NGG3bp）最好位于酶切位点中；如果手动设计靶点，可到http://www.rgenome.net/cas-offinder/网站评估脱靶情况；进一步地，可使用http://www.crisprscan.org/page=sequence网站预测靶点编辑效率；依据上述原则，针对部分基因利用CRISPR/Cas9系统进行编辑时，选择靶点序列（SEQIDNO.1~6所示）如下表1所示：表1，基因信息及CRISPR/Cas9系统使用的靶点序列注：表中靶点序列部分的最后三个碱基为对应基因的特异靶点序列。（1.2）靶位点引物设计依据步骤（1.1）中所设计靶位点，在靶位点上下游的200bp处设计所需检测引物，以用来检测转基因植物是否发生了敲除，或者用此引物扩增WT的基因组来验证所得到的基因序列与WT序列是否一致（需要注意的是靶位点处是否存在SNP）；具体引物设计原则如下：（1.2.1）假设单靶点结构如下：靶点P1，5’-ATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，靶点P2，3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’；因此可设计引物P1和P2如下（引物P1、引物P2中的19个“N”碱基呈反向互补关系），引物P1：5’-ATTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，引物P2：5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；需要强调的是，合成制备引物时必须分别携带5’端的A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，其特征在于，该方法用于筛选与鉴定利用CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体，具体包括如下步骤：（1）构建CRISPR/Cas9系统载体，根据目的基因序列信息，选取合适的靶点位置PAM，利用CRISPR/Cas9系统构建针对目的基因的特异性载体；（2）将步骤（1）中所构建的CRISPR/Cas9载体转化植物体，筛选获得转基因植株；（3）利用MSBSP‑PCR筛选纯合突变体；筛选时，首先设计PCR用引物，具体而言，根据目的基因选择的靶点分别设计靶点的上、下游引物和靶点特异性引物；MSBSP‑PCR反应时，包括两轮PCR反应，第一轮PCR，对潜在的纯合突变体烟草植株提取DNA，以此为模板，以靶点的上、下游引物进行PCR反应，此为第一轮PCR；第二轮PCR，以第一轮PCR反应的产物为模板，以靶点引物和靶点的下游引物配对，进行第二轮PCR反应；最后，对第二轮PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，同时以野生型作为对照，如果第二轮PCR产物较野生型少，或者第二轮PCR没有产物即为纯合突变体。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，其特征在于，该方法用于筛选与鉴定利用CRISPR/Cas9系统创建的纯合突变体，具体包括如下步骤：（1）构建CRISPR/Cas9系统载体，根据目的基因序列信息，选取合适的靶点位置PAM，利用CRISPR/Cas9系统构建针对目的基因的特异性载体；（2）将步骤（1）中所构建的CRISPR/Cas9载体转化植物体，筛选获得转基因植株；（3）利用MSBSP-PCR筛选纯合突变体；筛选时，首先设计PCR用引物，具体而言，根据目的基因选择的靶点分别设计靶点的上、下游引物和靶点特异性引物；MSBSP-PCR反应时，包括两轮PCR反应，第一轮PCR，对潜在的纯合突变体烟草植株提取DNA，以此为模板，以靶点的上、下游引物进行PCR反应，此为第一轮PCR；第二轮PCR，以第一轮PCR反应的产物为模板，以靶点引物和靶点的下游引物配对，进行第二轮PCR反应；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燃，苗雨晨，郭敬功，李坤，金立锋，魏攀，王中，祁超亚，张林，李锋，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，河南大学，
类型：发明
国别省市：河南,41