一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用，属于有机金属催化及生物检测技术领域，为解决生物蛋白标记物检测体系存储不方便、容易受到外部条件影响、检测方法应用范围被限制等问题，本发明专利技术采取了以下技术方案：1)在载体上包被抗体A；2)加入被测抗原生物蛋白标记物；3)加入过渡金属催化剂修饰的标记抗体B；4)加入含有氧化还原荧光探针的氧化还原荧光检测液，过渡金属催化剂催化荧光探针分子产生荧光信号，通过检测检测液的荧光强度可实现对被测抗原生物蛋白标记物的定量检测。实现对检测样品的超快、灵敏检测，具有操作简便、检测快速、准确性好、成本低、灵敏度高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用
本专利技术涉及有机金属催化及生物检测
，具体地说，涉及过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用。
技术介绍
生物蛋白标记物的检测被认为是各种疾病检测及诊断的基石，因此开发灵敏、稳定、准确、低价的蛋白标记物检测方法具有十分重要的意义。目前，关于疾病标记物的检测技术主要是利用了抗原抗体特异性结合的原理，其中最经典的方法是酶联免疫吸附法。该方法是基于抗原抗体的特异性结合并引入酶标抗体，最终通过检测酶催化反应的程度对抗原或抗体进行定量检测的方法。然而，在检测过程中使用酶标抗体作为催化放大系统，不仅储存不方便，而且酶的活性容易受到外部条件的影响。酶催化反应对实验条件的苛刻要求限制了这种检测方法的广泛应用。
技术实现思路
为解决上述生物蛋白标记物检测体系存储不方便、容易受到外部条件影响、检测方法应用范围被限制等问题，本专利技术提供一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用。为实现上述目的，本专利技术采取了以下技术方案。一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用。包括以下步骤：1)在载体上包被能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的包被抗体A；2)加入被测抗原生物蛋白标记物，使被测抗原生物蛋白标记物与固定在载体上的包被抗体A特异性结合；3)加入过渡金属催化剂修饰的、能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的标记抗体B，使标记抗体B与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合；4)加入含有氧化还原荧光探针的氧化还原荧光检测液，过渡金属催化剂催化荧光探针分子产生荧光信号，通过检测检测液的荧光强度可实现对被测抗原生物蛋白标记物的定量检测。步骤1)所述载体为聚苯乙烯酶标板、磁珠；所用磁珠包含氨基磁珠、羧基磁珠、环氧磁珠、生物素链酶亲或素磁珠中的一种或二种以上，其中氨基磁珠或羧基磁珠负载蛋白前需首先采用戊二醛或水溶性的碳二亚胺缩合剂进行活化；包被抗体A通过化学吸附固定在载体上或通过化学反应连接在载体上后用牛血清白蛋白(BSA)封闭。所述聚苯乙烯酶标板可采用96孔酶标板、48孔酶标板、384孔酶标板等不同孔数的酶标板，酶标板均包含可拆与不可拆两种型号，酶标板的颜色包含黑色、白色以及无色透明色。步骤2)具体为：向步骤1)所得载体中加入待测抗原生物蛋白标记物溶液，在37℃条件下孵育1-3h。步骤3)具体为：向步骤2)所得载体中加入过渡金属催化剂修饰的、能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的标记抗体B，在37℃条件下孵育1-3h。步骤3)中所述过渡金属催化剂修饰的方法为：取过渡金属催化剂溶于10-100mM的磷酸缓冲溶液中，使过渡金属催化剂浓度为0.01-1.00mg/mL，调节pH为7.2-7.5，加入终浓度为0.5-2.0mg/mL的NHS，向上述体系中加入5mg·mL-1标记抗体B，加入量为每10mL所述体系加入标记抗体B1-5μL，摇床混合12-24h；向所得体系中分别加入1-5％(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)和1-5％(v/v)的甲酸，每10mL所述体系二者加入量均为200μL，25℃摇床上混合12h，得到过渡金属催化剂标记抗体溶液，置于4℃条件下保存备用。步骤3)所述过渡金属催化剂的分子结构为：中的一种或二种以上，其金属中心M为钌(Ru)、铱(Ir)、铑(Rh)或铁(Fe)中的一种或二种以上，配体结构R为羧基(—COOH)、氨基(—NH2)或叠氮(—N3)偶联基团中的一种或二种以上，可对蛋白分子进行修饰，X为H2O、Cl或Br中的一种或二种以上，催化剂负离子包括六氟磷酸根(PF6-)、四氟硼酸根(BF4-)、硫酸根(SO42-)或硝酸根(NO3-)中的一种或二种以上，催化剂二氮类配体分别为邻二氮杂菲、2,2’-二联吡啶或2,2’-二联嘧啶、烟酰胺、苯基亚胺中的一种或二种以上。步骤3)中标记抗体B与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合，从而将过渡金属催化剂固定在载体上。步骤3)所述过渡金属催化剂能够在氢源，如甲酸、柠檬酸、苯硼酸、还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、三(2-羧乙基)膦TCEP存在下，催化步骤4)所述氧化还原调控荧光探针分子中的氧化还原官能团还原，同时探针分子荧光强度发生改变。由于不同浓度的过渡金属催化剂所引起的荧光强度的变化程度是不同的，采用荧光光谱仪对体系荧光强度的变化进行测量可实现对待测样品的定量分析。步骤3)所述金属催化以甲酸、还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、异丙醇/异丙醇钠、异丙醇/氢氧化钠、水合肼或硼氢化钠作为氢源，可促使过渡金属催化剂分子中的H2O、Cl或Br转换为H，进而可催化探针分子中的氧化基团发生还原，产生荧光变化。步骤4)具体为：向步骤3)所得载体中加入氧化还原荧光检测液20-100℃反应10-100min后，检测荧光强度。步骤4)中所述氧化还原荧光检测液的组成为：有机溶剂(包括二甲基亚砜DMSO或N，N-二甲基甲酰胺DMF或乙醇或甲醇或乙腈或二氧六环)10-90％(V/V)，水90-10％(V/V)，有机溶剂与水的体积和为100％(V/V)；最终浓度在1-1000μM的氧化还原荧光探针分子；最终浓度为10-1000mM的甲酸、最终浓度为10-1000mM的甲酸钠；pH为3-10。步骤4)中所述氧化还原荧光检测液的配制方法为：将氧化还原荧光探针分子溶于有机溶剂(包括二甲基亚砜DMSO或N，N-二甲基甲酰胺DMF或乙醇或甲醇或乙腈或二氧六环)与水的混合溶剂(含10％-90％V/V的DMSO)中，使氧化还原荧光探针分子的最终浓度保持在1-1000μM，向混合溶剂中分别加入甲酸和甲酸钠，保持溶液中甲酸和甲酸钠的最终浓度均为10-1000mM，调节混合液pH＝3-10；各成分超声混合均匀后，置于4℃条件下保存备用。步骤4)所述荧光探针为氧化还原调控型探针，分子结构为：中的一种或二种以上；探针分子均含有氧化还原活性官能团，其氧化还原活性官能团包含对苯醌、邻苯醌、辅酶Q0、硝基、羰基、叠氮，探针分子荧光团包括罗丹明、萘酰亚胺、香豆素，同时，根据荧光响应过程，探针可分为还原型荧光“开-关”探针(包括探针分子P-1、P-2)和还原型荧光“关-开”探针(包括探针分子P-3、P-4、P-5)两种类型。有益效果本专利技术将氧化还原调控荧光探针与过渡金属催化剂相结合，同时基于特异的抗原-抗体免疫反应，建立灵敏、快速的金属催化荧光调控生物蛋白标记物体外检测方法。所述荧光调控体系利用过渡金属催化剂催化荧光探针分子中氧化还原活性官能团(醌、硝基、羰基、烟酰胺)的氧化还原性质，诱导探针分子结构或电子分布发生改变，从而使荧光探针分子产生一个从无到有或从强到弱的荧光变化，所述荧光强度的变化可通过荧光光谱仪或酶标仪直接判断和测量。本专利技术的目的在于针对传统免疫检测技术中存在的不足，开发新的荧光蛋白检测手段。基于传统的蛋白免疫反应，以高效、稳定、廉价的有机过渡金属催化反应代替酶催化反应，并引入氧化还原荧光调控体系，提供一种基于过渡金属催化荧光特异性响应的生物蛋白标记物检测方法。它能实现对检测样品的超快、灵敏检测，具有操作简便、检测快速、准确性好、成本低、灵敏度高的优点，可在生物标记蛋白体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种基于过渡金属催化氧化还原荧光调控体系在生物蛋白标记物检测中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：包括以下步骤：1)在载体上包被能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的包被抗体A；2)加入被测抗原生物蛋白标记物，使被测抗原生物蛋白标记物与固定在载体上的包被抗体A特异性结合；3)加入过渡金属催化剂修饰的、能够与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合的标记抗体B，使标记抗体B与被测抗原生物蛋白标记物特异性结合；4)加入含有氧化还原荧光探针的氧化还原荧光检测液，过渡金属催化剂催化荧光探针分子产生荧光信号，通过检测检测液的荧光强度可实现对被测抗原生物蛋白标记物的定量检测。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于：步骤1)所述载体为聚苯乙烯酶标板或磁珠；所用磁珠包含氨基磁珠、羧基磁珠、环氧磁珠、生物素链酶亲或素磁珠中的一种或二种以上，其中氨基磁珠或羧基磁珠负载蛋白前需首先采用戊二醛或水溶性的碳二亚胺缩合剂进行活化。4.根据权利要求2所述应用，其特征在于：步骤3)中所述过渡金属催化剂修饰的方法为：取过渡金属催化剂溶于10-100mM的磷酸缓冲溶液中，使过渡金属催化剂浓度为0.01-1.00mg/mL，调节pH为7.2-7.5，加入终浓度为0.5-2.0mg/mL的NHS，向上述体系中加入5mg·mL-1标记抗体B，加入量为每10mL所述体系加入标记抗体B1-5μL，摇床混合12-24h；向所得体系中分别加入1-5％(v/v)的牛血清白蛋白(BSA)和1-5％(v/v)的甲酸，每10mL所述体系二者加入量均为200μL，25℃摇床上混合12h，得到过渡金属催化剂标记抗体溶液，置于4℃条件下保存备用。5.根据权利要求2所述应用，其特征在于：步骤3)所述过渡金属催化剂的分子结构为：中的一种或二种以上，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵立军，咸漠，邓理，尹衍龙，赵晓辉，董文锦，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37