本发明专利技术公开了一种靶向QKI的纳米颗粒及其在细菌性脓毒症预防、抗感染中的应用，所述纳米颗粒为靶向QKI的负载siRNA的磷酸钙脂质混合纳米颗粒。该颗粒能够特异性降低单核巨噬细胞中QKI的表达水平，增强巨噬细胞的杀菌能力，提高细菌性脓毒症生存率，对脓毒症的发生具有预防作用，可应用于制备多种细菌(包括耐药细菌)性脓毒症预防及治疗药物。
Nanoparticle targeting QKI and its application in prevention and anti infection of bacterial sepsis
The present invention discloses a nanoparticle targeting QKI and its application in the prevention and anti infection of bacterial sepsis, and the nanoparticles are calcium phosphate mixed nanoparticles with a load siRNA of the target QKI. This particle can specifically reduce the expression of QKI in mononuclear macrophages, enhance the bactericidal ability of macrophages, improve the survival rate of bacterial sepsis, and have a preventive effect on the occurrence of sepsis. It can be used to prepare a variety of bacteria, including drug resistant bacteria, sepsis preprevention and treatment drugs.
【技术实现步骤摘要】
一种靶向QKI的纳米颗粒及其在细菌性脓毒症预防、抗感染中的应用
本专利技术属于生物技术和医学领域，具体涉及一种靶向QKI的纳米颗粒及其在多种细菌(包括耐药细菌)性脓毒症预防、抗感染中的应用。
技术介绍
脓毒症是一种由细菌等病原菌感染所引发的系统性炎症，严重时可以导致多器官急性损伤甚至死亡。据统计，欧洲ICU病人脓毒症患病率大于35％，病死率达27％。病原菌感染是引发脓毒症的首要因素，以往认为革兰氏阴性菌引发的脓毒症居多，近年来研究发现，革兰氏阳性菌和真菌所致脓毒症的比重越来越大。一项针对全球37个国家11000例脓毒症患者的研究显示，44％的患者为革兰氏阳性菌感染。抗生素及很多天然化合物都具有抗菌和抗感染的作用，比如从植物提取的倍半萜内酯，具有抗炎、抗菌以及抗感染的能力；地塞米松NO释放衍生物ND8008，被认为具有清除病原菌的作用。近年来随着抗感染药物的不断发展，虽然脓毒症的治疗水平有所提高，但是目前所使用的传统抗感染药物仍具有靶向性和特异性差等缺点，尤其对于一些耐药菌引发的感染，若不能及时清除侵入的病原菌，将会引起机体的不可逆损伤，甚至死亡。脓毒症的发病机制非常复杂，细菌性肺炎和腹膜炎是引发脓毒症的重要诱因。固有免疫作为机体清除入侵病原体的第一道防线，其功能受损会导致机体清除病原菌能力下降，进而引发多器官衰竭、死亡。单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、噬碱性粒细胞等是固有免疫的重要组成细胞，它们通过吞噬、杀伤病原菌，参与炎症反应的发生、发展及消融等各个阶段，维持机体稳态。巨噬细胞能够识别、吞噬、杀伤病原菌，而且产生ROS和NO等过氧化物清除吞噬的胞内菌，减少并防止细菌在机体循环系统繁殖；另一方面巨噬细胞可以释放TNF-α，IL-6等细胞因子，促进机体的抗菌免疫。RNA结合蛋白QKI是STAR家族(SignalsTransductionsandActivatorsofRNAs)成员，由qki基因编码，广泛表达于全身多种组织器官。目前研究已经证实：QKI蛋白在神经髓鞘形成和胚胎发育过程中都有至关重要的作用。随着新型药物包裹技术的出现，既缩短了传统药物研发的周期，又能够增强靶向性，大大提高了成药效率。目前纳米包裹小干扰RNA(siRNA)的技术已经得到了充分认可和广泛应用，尤其在肿瘤的靶向治疗中取得了重大突破和进展。一些天然或合成高分子及无机非金属纳米粒子，利用其被动靶向或表面修饰特异性分子识别官能团的主动靶向作用，携载药物直接作用于靶细胞，为靶向性治疗提供了一种有效方案。磷酸钙是一种较理想的药物载体材料，它与机体的骨和牙的主要无机成分类似，磷酸钙纳米粒子的嗜酸性降解可保证其在正常的生理条件下稳定，而在细胞内吞包囊、溶酶体或肿瘤周围等低pH环境中才降解为人体所需的Ca2+和PO43+，因此具有良好的生物相容性和生物可降解性。目前亟待解决如何巨噬细胞，增强其吞噬、杀伤功能，从而为脓毒症的治疗提供新的策略。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种靶向QKI的纳米颗粒及其在细菌性脓毒症预防、抗感染中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种靶向QKI的纳米颗粒，包括纳米颗粒药物载体以及负载于该药物载体上的靶向RNA结合蛋白QKI的siRNA(靶向QKI的siRNA简称为si-QKI)。优选的，所述药物载体选自磷酸钙脂质混合纳米颗粒等可以将siRNA转运至细胞内的药物载体。优选的，所述靶向RNA结合蛋白QKI的siRNA特异性降低巨噬细胞中QKI的表达水平。优选的，所述药物载体的制备方法包括以下步骤：①将100-200μL氯化钙水溶液与50-80μL的si-QKI水溶液混合，得到溶液A，20-28℃下孵育10～15分钟；②将20-30mmol/L磷酸氢二钠水溶液和15-25mg/mL二油酰磷脂酸(DOPA)水溶液加入由环己烷/壬基酚聚氧乙烯醚(V/V＝71/29)组成的溶液中，搅拌均匀，形成含有磷酸根离子的油包水微乳液B；③将溶液A加入另外一个由环己烷/壬基酚聚氧乙烯醚(V/V＝71/29)组成的溶液中，形成含有钙离子和si-QKI的油包水微乳液C；④将油包水微乳液B和油包水微乳液C混合，搅拌30-60分钟后加入无水乙醇，然后静置1-1.5小时，高速离心、分离及洗涤沉淀，得到磷酸钙沉淀；⑤将所述磷酸钙沉淀与阳离子脂质及胆固醇于介质中混合后蒸发除去介质，然后真空干燥16-20小时、水化，得到LNPS@si-QKI(即负载si-QKI的磷酸钙脂质混合纳米颗粒)溶液。利用紫外分光光度计可检测纳米颗粒中siRNA的负载率。优选的，所述步骤①中，溶液A中氯化钙的浓度为375-750mmol/L，si-QKI的浓度为1.05-1.68mg/mL。所述步骤②中，油包水微乳液B含有浓度为0.5-1.0mmol/L的磷酸氢二钠及浓度为0.5-1.0mg/mL的二油酰磷脂酸。所述步骤③中，油包水微乳液C含有浓度为10-20μmol/mL的氯化钙及浓度为10-20μg/mL的si-QKI。所述步骤④中，油包水微乳液B和油包水微乳液C的体积比为0.9-1:1。所述步骤⑤中，阳离子脂质的质量是溶液A中siRNA质量的19-23倍，胆固醇的体积为1.9-2.3mL。优选的，所述siRNA的序列如SEQ.ID.NO.1所示。上述靶向QKI的纳米颗粒(或si-QKI)在制备防治感染性疾病的药物中的应用。上述靶向QKI的纳米颗粒(或si-QKI)在制备防治与QKI分子高表达相关炎性疾病的药物中的应用，特别是在制备预防、治疗多种细菌(包括耐药细菌)性脓毒症的药物中应用。所述靶向QKI的纳米颗粒促进巨噬细胞吞噬及清除病原菌，提高生存率。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术所述靶向QKI的纳米颗粒，能够有效降低小鼠巨噬细胞及小鼠腹腔来源单核巨噬细胞中QKI的表达水平，利用其作为si-QKI的递送系统，可增强巨噬细胞的杀菌能力，提高细菌性脓毒症生存率，对脓毒症的发生具有预防作用，可应用于制备多种细菌(包括耐药细菌)性脓毒症、感染性疾病的预防及治疗药物。本专利技术以磷酸钙脂质混合纳米粒为药物载体，使靶向QKI的siRNA高效进入巨噬细胞，特异性降低巨噬细胞中QKI的表达水平，用于制备预防、治疗与QKI分子高表达相关炎性疾病(如脓毒症等)的药物。附图说明图1a为负载si-QKI的磷酸钙脂质混合纳米粒LNPS@si-QKI的粒径分布图。图1b为负载si-QKI的磷酸钙脂质混合纳米粒LNPS@si-QKI的zeta电位分布图。图1c为经不同浓度(100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL)负载si-QKI的磷酸钙脂质混合纳米粒LNPS@si-QKI处理后的巨噬细胞RAW264.7的QKI的mRNA表达水平real-timePCR检测结果。图1d为不同浓度(100ng/mL、150ng/mL)负载si-QKI的磷酸钙脂质混合纳米粒LNPS@si-QKI处理对巨噬细胞RAW264.7吞噬金黄色葡萄球菌数目的影响。图2a为小鼠注射不同浓度(200μg/kg、280μg/kg、400μg/kg)的负载si-QKI的磷酸钙脂质混合纳米粒LNPS@si-QKI后小鼠腹腔单核巨噬细胞QKI的mRNA表达水平real-timePCR检测结果。图2b为小鼠脓毒症感染本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向QKI的纳米颗粒，其特征在于：包括纳米颗粒药物载体以及负载于该药物载体上的靶向RNA结合蛋白QKI的siRNA。
【技术特征摘要】
1.一种靶向QKI的纳米颗粒，其特征在于：包括纳米颗粒药物载体以及负载于该药物载体上的靶向RNA结合蛋白QKI的siRNA。2.根据权利要求1所述一种靶向QKI的纳米颗粒，其特征在于：所述药物载体选自可以将siRNA转运至细胞内的药物载体。3.根据权利要求1所述一种靶向QKI的纳米颗粒，其特征在于：所述靶向RNA结合蛋白QKI的siRNA特异性降低巨噬细胞中QKI的表达水平。4.根据权利要求1所述一种靶向QKI的纳米颗粒，其特征在于：所述siRNA的序列如SEQ.ID.NO.1所示。5.一种靶向RNA结合蛋白Q...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪莉，贾俊峰，翟东昇，叶子晨，卢环宇，向安，杨媛，卢兹凡，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61
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