本发明专利技术公开一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用，属于生物技术领域。该系统由小核酸药物、包裹小核苷酸药物的脂膜囊状物及其靶向肿瘤细胞的靶头组成，特别提供了靶头是基于适配体AS1411，脂膜囊状物为外泌体来共同组成的递送let‑7的给药系统。本发明专利技术除了提供上述系统的制备方法，还提供了上述AS1411‑exosome‑let‑7在细胞水平和小鼠在体水平的靶向性检测结果和抗肿瘤的应用，结果说明采用AS1411‑exosome，与单独的exosome相比在细胞水平和小鼠体内均有更强的靶向性，而且可将let‑7更有效的递送到肿瘤组织中发挥抑制肿瘤增殖和迁移功能。
An anti-tumor targeting drug delivery system and its preparation method and Application
The invention discloses an anti-tumor targeting drug delivery system and a preparation method and application thereof, belonging to the field of biotechnology. The system is composed of small nucleic acid drugs, liposome encapsulated small nucleotides and target tumor cells targeting tumor cells, especially the target is the delivery system of delivery let 7, which is based on the aptamer AS1411 and the fat membrane sacs as exosecreting. In addition to providing a preparation method of the above system, the present invention also provides the target detection results and anti-tumor application of the above AS1411 exosome let 7 at the cell level and in the body level of mice, and the results show that the AS1411 exosome is used to be more targeted in the cell level and in the mice compared with the individual exosome. Moreover, let 7 can be delivered to tumor tissues more effectively to inhibit tumor proliferation and migration.
【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用
本专利技术属于生物
，涉及一种药物给药系统，具体涉及一种抗肿瘤靶向给药系统及其制备方法与应用。
技术介绍
近年来，核酸药物在人类重大疾病尤其是肿瘤治疗的研究中显示出了巨大潜力，为现代生物医药产业开辟了一个崭新的方向。但是裸露的核酸药物存在以下缺点：(1)核酸药物在组织或细胞中易被核酶降解；(2)核酸药物的细胞靶向能力较差；(3)核酸药物自身带有负电荷，与带有负电荷的细胞膜之间存在排斥作用，导致其细胞内吞和逃逸内涵体的能力较差。以上缺点导致核酸药物的治疗效果不佳。因此，需要寻求合适的载体负载核酸药物，将其递送到靶细胞，有效逃离内涵体吞噬，释放基因治疗药物进入细胞质，以实现该药物的高效表达。所以目前核酸药物治疗领域中最大的瓶颈就是核酸药物载体。传统的基因药物主要依靠病毒载体运输，但是病毒作为药物载体，可能引起免疫反应、整合入基因组的隐患及病毒具有复活毒性的可能等所造成的系列安全问题一直饱受争议。另有许多科学家利用纳米粒子(LPNs)作为基因药物载体，如阳离子脂质及脂质类似物或阳离子多聚体，例如多聚赖氨酸、多聚精氨酸、组蛋白、脱乙酰壳多糖、聚乙烯亚胺(PEI)等。但是脂质体给药系统上存在缺乏靶向性、转染率低和全身给药的毒性等问题。因此其毒性和递送药物的脱靶效应等问题，限制了脂质体在体内的应用。此外，研究发现利用聚合物载体作为基因传递系统效率非常低，大多被陷在了细胞回收利用器—胞内体中，只有极少数核酸药物可以被运到细胞质中发挥作用。GauravSahay对纳米颗粒运输siRNA进入细胞质的效率进行了深入研究，发现大多数的siRNAs陷入到了细胞的胞吞回收通路中，一些随后移动到溶酶体(lysosome)中被降解；而另一些则基本困在了内吞膜泡(endocyticvesicles)中，只有极少数的siRNA能够达到细胞质发挥生物功能。因此，选择一种具有高效性、靶向性和安全性非病毒基因药物载体是基因治疗领域中最主要、最关键的问题之一。Exosome是由细胞内多胞体(multivesicularbody，MVB)与细胞膜融合后释放到细胞外基质的一种直径约为30～120nm的小囊泡。大多数生物细胞都可以分泌这种小囊泡，并且它们天然存在于体液中，如血液、唾液、尿液和母乳等。无论是培养基中的exosome，还是各种器官分泌到体液中的exosome，都像货车(cargo)一样运载货物然后穿梭于各种细胞参与细胞间通信、免疫反应的促进、抗原呈递、程序性细胞死亡、血管生成、炎症和凝血等。Exosome的蛋白质组学分析结果显示，不同类型的细胞和体液(血液、乳汁和尿液)中，exosome膜上或泡内含有相同的标记蛋白分子，这些分子分别来自细胞质、质膜及高尔基体和内质网的生物膜。典型的exosome标记蛋白有：(1)四跨膜蛋白超家族，如CD9、CD63和CD81蛋白；(2)细胞质蛋白，如肌动蛋白(actin)、钙磷脂结合蛋白(annexins)、Rab蛋白；(3)参与生物合成的分子，如凋亡连接基因2相互作用蛋白X(apoptosis-linkedgene2-interactingproteinX，ALIX)、肿瘤易感基因101的蛋白质(tumorsusceptibilitygene101，TSG101)、热休克蛋白(heatshockproteins，HSPs)70和热休克蛋白90。2007年Valadi等发现，MC/9和人肥大细胞系分泌的exosome包含了约1300个基因的mRNA以及smallRNA，其中包括121个microRNA。这项研究让人们意识到miRNA功能可能不仅仅在细胞内调控基因表达，还可以利用exosome这个运载工具通过各种体液在细胞间进行信息的传递。与其它转运膜泡和载体相比，exosome作为药物载体有诸多优越性：如在血液中能够稳定存在；以及用病人自身的exosome会有较低的免疫原性等；且组织特异性的exosome可以携带miRNA、miRNA的拮抗物和小的效应分子靶向穿梭于特定组织中。2011年英国科学家Alvarez-Erviti.L等人报道了从实验鼠的树突状细胞内提取出来的exosome，让其与从实验鼠的病毒中提取出来的蛋白质靶头—脑特异性识别多肽—RVG结合在一起。随后他们将GAPDHsiRNA通过电转方式装载到exosome中，再将此exosome复合体从体外注射到小鼠体内。利用exosome的内源性、通透性特点突破血脑屏障，将siRNA递送到大脑细胞并敲除基因BACE1(该基因与与阿尔茨海默病相关)。结果显示，BACE1基因的表达降低了60％。这是科学家首次使用天然系统向大脑内递送药物。一年后，瑞典的WahlgrenJ团队通过电转染的方式将siRNA装载到正常人类血清来源的exosome中，证明装载siRNA的exosome可以有效地传递MAKP1-siRNA到作为受体的外周血单核细胞，体外敲除了特定基因。T.A.Shtam等也用类似的方法递送RAD51-siRNA和RAD52-siRNA来诱导两个基因的敲除并降低纤维素肉瘤细胞的生存和增殖。L.Alvarez-Erviti等在研究中发现，在靶向递送富含siRNA的exosome后，无论管家基因mRNA如GAPDH表达的下调还是阿尔茨海默病相关的基因BACE1的下调，都能在被靶向递送的特定神经细胞中被观察到。还有一些关于短发夹RNAs(shRNA)的使用和所谓的自我递送RNAs被包含在exosome中作为治疗药物的研究。例如，Q.Pan等研究发现，一种抑制病毒进入受体和丙型肝炎病毒(HCV)复制的shRNA，通过exosome介导可以使肝细胞的HCV的感染率降低。因为exosome天生携带miRNAs，这一特征的治疗应用也是符合逻辑的，正如一些将这一方法应用于不同疾病模型的研究所阐述的那样。研究发现Exosome包裹的miR-150能降低内皮细胞的迁移，介导效应T细胞的抑制；当293T细胞培养在含有exosome(来自miR-122转导的293T细胞)的条件培养基时，细胞内的miR-122的表达提高数倍。在体外，富含miR-133b的MSCexosome提高了神经突触的生长速率，提示这种MSCexosome成为大脑缺血的潜在治疗药物。另外，miR-214可以通过exosome穿梭到肝星状细胞，造成CCN2表达的降低，而CCN2基因在调控肝脏纤维化中起到很重要的作用。正如近期HeidiG等对多形性成胶质母细胞瘤(GBM)的评论中表述的那样，大多数肿瘤类型都有miRNAs的异常表达。MSC衍生的exosome抑制miRNA--miR-146b的高表达，在GBM的异植瘤模型中可抑制肿瘤的生长，显示了exosome-based药物递送和miRNA-based治疗两者之间存在的相关性。在外GBM细胞体研究中，MSC分泌的exosome递送anti-miRs来敲除致癌的miR-9从而提高了GBM细胞对替莫唑胺化学治疗的敏感性。exosome递送miR-143和let-7a，在体外可分别抑制前列腺癌和乳腺癌的生长。但在正常的前列腺上皮细胞中用装载miR-143的exosome处理后没有观察到类似的效果。E本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于由小核酸药物、包裹小核苷酸药物的脂膜囊状物及其靶向肿瘤细胞的靶头组成。
【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于由小核酸药物、包裹小核苷酸药物的脂膜囊状物及其靶向肿瘤细胞的靶头组成。2.根据权利要求1所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：所述的脂膜囊状物是来自细胞内源产生的外泌体或者内囊泡，或是外源人工合成的脂质体。3.根据权利要求2所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：所述的外源人工合成的脂质体为离子脂质体、单层脂质体、多层脂质体或多囊脂质体；所述的外泌体来自于免疫细胞、间充质干细胞、间质细胞或上皮细胞，但不包括来自任何肿瘤细胞。4.根据权利要求1所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：所述的靶头是多肽、人工合成的化合物、天然产物或者核苷酸类物质。5.根据权利要求4所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：所述的多肽为整合素亲和多肽RGD、血管活性肠肽VIP或P32受体亲和肽LyP-1；所述的核苷酸类物质为适配体。6.根据权利要求5所述的抗肿瘤靶向给药系统，其特征在于：所述的适配体为适配体AS1411、适配体NOX-A12或适配体NOXXON。7...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈小佳，王晓刚，洪岸，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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