一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，包括如下步骤：步骤（1）、样品采集；步骤（2）、稀释样品；步骤（3）、洗脱细胞；步骤（4）、收集滤液；步骤（5）、收集沉淀物；步骤（6）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的标定；步骤（7）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位鉴定；步骤（8）、盲肠蛋白质水解细菌的丰度的确定及统计分析。本发明专利技术较大地降低了劳动强度，成本较低，操作过程简便，实验结果准确无误，能迅速提供给饲养人员相关的信息和数据，缩短筛选优质饲料配方的过程，能快速提供給饲养人员肉鸡盲肠蛋白质降解细菌的信息和数据，为确定特殊的饲料配方，在特殊的饲养条件下对肉鸡的生产性能和健康的影响程度。

A method for rapid detection of protein hydrolysates in cecum of Broilers

The present invention relates to a method for rapid detection of proteolytic bacteria of broiler cecum, including steps: step (1), sample collection; step (2), dilution sample; step (3), eluant; step (4), collection filtrate; step (5), collect sediment; step (6), broiler cecum protein water Demarcation of bacteria; step (7) identification of protein hydrolysate bacteria in broiler; step (8), determination and statistical analysis of the abundance of proteolytic bacteria in the cecum. The invention has lower labor intensity, low cost, simple operation process, accurate experimental results, and can quickly provide information and data to feed personnel, shorten the process of screening high quality feed formula, and can quickly provide information and data to the poultry cecum protein degrading bacteria. The effect of special feed formula on the performance and health of broilers under special feeding conditions.

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法
本专利技术涉及一种快速检测蛋白质水解细菌的方法，一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法。
技术介绍
肉鸡的肠道健康是肉鸡生长所必须的条件之一。肠道菌群的平衡对维持健康的肠道取着重要的功能。肠道内稳态紊乱会影响肠道功能和健康，导致生理失调，危害肉鸡健康并导致生长性能下降。对无菌肉鸡的研究显示，肠道微生物能够促进肠道成熟，提高机体免疫力，抑制病原菌，促进肉鸡生长，降解不易消化的食物，能够产生挥发性脂肪酸、维生素，因此肠道微生物在肠道发育及功能发挥方面具有重要的作用。近年来，随着肉鸡饲养周期的逐年下降，目前肉鸡在5周内食用3.0公斤饲料后，鸡体重可达2.0公斤。快速增长的肉鸡生长速度与过去几十年来人们选择高转化率的饲粮蛋白质而导致的高采食量有关。在实际肉鸡的饲养过程中，饲粮配方中的高转化率蛋白质常常含有一定量未能消化的蛋白质，这部分蛋白质一旦进入肉鸡的盲肠，盲肠微生物菌群就利用它们作为降解的底物并产生能源来促进微生物菌群自身的增殖。近年来，由于需要向快速生长的肉鸡提供含有高转化率蛋白质的饲粮，因而导致了饲粮中未经消化的蛋白质流入盲肠进而发酵的数量增加，这部分蛋白质发酵的产物对肉鸡肠道健康的影响越来越受到关注。在肉鸡的小肠和盲肠中，氨基酸和蛋白质的代谢机制是不同的。小肠中的微生物菌群与宿主竞争饲粮中的氨基酸，并吸收氨基酸合成自身新的细胞；盲肠微生物菌群则仅利用逃脱宿主消化的蛋白质和氨基酸。前期研究证明最优质的饲粮配方也不能保证所有的饲粮蛋白质都在小肠内被宿主吸收，总是有一部分蛋白质会逃脱宿主消化而流入盲肠，通过盲肠微生物进行分解发酵。一般来说，流入盲肠的蛋白质包括饲粮中的抗性蛋白质(不能被宿主蛋白酶或小肠细菌消化的蛋白质，其数量取决于饲粮蛋白质的原料或饲料加工质量)、微生物蛋白质(小肠乳酸杆菌和其他细菌竞争氨基酸，不可避免地吸收一些膳食氨基酸并利用它们进行合成代谢)和宿主合成和分泌的蛋白质(内源蛋白)。现代肉鸡的饲养过程中，通过利用高转化率的饲粮蛋白质来提高肉鸡生长速度的同时，不仅要减少小肠微生物和宿主竞争营养物质，同时也要监控盲肠中的蛋白质的数量，以便及时调整饲粮的组成结构，降低因盲肠蛋白质代谢产生的有毒物质而导致宿主健康问题的风险。在饲粮蛋白质转化率较高的情况下，蛋白质容易消化，小肠中的微生物蛋白质保持最低量，用于防御的内源蛋白质的分泌物不应过高。一旦饲粮蛋白质脱离了宿主消化，并且不能用于宿主，未经消化的饲粮蛋白质进入盲肠，增加了蛋白质在盲肠的分解发酵水平，导致了盲肠蛋白质发酵产生的有毒代谢产物对肉鸡肠道后端的功能、肉鸡健康、肉鸡生产性能的负面影响。由于饲粮是肠道微生物最重要的生长基质，饲粮的组成和消化率对肠道微生物群体有着重要影响。现代肉鸡的饲养不仅要求符合营养需要的饲粮配方，还要考虑利用饲粮配方的组成来调控微生物菌群的代谢活性对宿主健康和生产性能的影响。当饲粮中的淀粉和可发酵的碳水化合物有限或蛋白质丰富时，未经消化的饲粮蛋白质进入肉鸡盲肠通过盲肠中的致腐细菌进行发酵反应，盲肠蛋白质发酵产物除了包括对肉鸡生长有益的氨基酸、挥发性脂肪酸(VFA)和支链脂肪酸(BCFA)等产品之外，同时还产生许多有害和有毒的化合物，包括氨、生物胺、吲哚、酚、甲酚等。氨很容易被肉鸡从肠道吸收到血液中，对肠内细胞具有毒性作用；生物胺虽然参与到肠道细胞中的各种生理过程，但高浓度的生物胺会降低肉鸡的生长速度并增加肉鸡的死亡率，肉鸡盲肠蛋白质代谢的有毒产物最终降低了饲料转化率，对肉鸡的生长和性能产生不利影响。为了降低盲肠中蛋白质发酵代谢产物-毒性的产生，近年来，国内外科学家开展了很多研究，主要集中在怎样通过改变肉鸡饲粮的配方来减少进入盲肠的饲粮中不能降解的蛋白质的总量：(1)促进小肠上段蛋白质的消化和增加抵抗回肠消化的可溶性碳水化合物的酶；(2)筛选使用各种不同的粗颗粒(600至900μm)饲料和/或使用饲料添加剂(例如益生菌和益生菌和有机酸，特别是丁酸)的饲料改善饲粮蛋白质消化；(3)筛选饲粮中最佳的可发酵的蛋白质和碳水化合物的比例，如果可发酵的碳水化合物不足，则可能发生盲肠蛋白质发酵，因为碳水化合物是盲肠微生物的优选能量来源；(4)筛选不同来源的蛋白酶在体外进行饲料预处理过程，提高肉鸡饲粮蛋白质的转化率。一直以来，人们对将某些肉鸡盲肠功能菌群与肉鸡的健康和生产性能联系起来一直很感兴趣。现有的研究表明，通过特定的盲肠功能菌群来监控肉鸡肠道微生物菌群的变化，对维持肉鸡肠道健康进而提高肉鸡生产性能是有效的策略。由于肉鸡消化食糜在盲肠停留的时间最长，为微生物群体提供了稳定的环境，盲肠是饲粮中未经消化蛋白质发酵的主要场所。水解是蛋白质分解发酵的第一步，到目前为止，关于肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的信息很少，只有很少的纯培养研究结果揭示了盲肠中的蛋白质水解细菌包括乳酸菌属(Lactobacillusspp.)、梭菌属(Clostridiumspp.)、肠球菌属(Enterococcusspp.)和拟杆菌属(Bacteroidesspp.)，梭菌属和肠球菌属的细菌参与氨的产生，拟杆菌属的细菌参与释放一些潜在的毒性的代谢产物，如生物胺，酚类和吲哚类，但是这些研究结果都没有在原位(insitu)(不需要通过纯培养分离菌株)状态下得到证实。由于盲肠中仅有20％的细菌能在培养基中生长，而且通过纯培养研究得到的微生物的生理生化信息不一定能反映微生物在复杂的生态系统原位的作用和功能。由于传统微生物纯培养技术的局限性，研究肉鸡盲肠微生物菌群的变化及探讨饲粮组成变化对盲肠微生物功能菌群的影响受到限制。而通过针对特定盲肠功能菌群调控整个肉鸡肠道菌群是维持肉鸡肠道健康进而提高肉鸡生产性能的有效策略。目前新一代DNA测序和生物信息学分析等新技术包括定量PCR、基于PCR的DNA图谱技术、流式细胞术、DNA测序、DNA微阵列和稳定同位素探针、Omics技术(包括宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学)等分子技术结合动物模型及生物信息学被广泛用于分析肉鸡盲肠功能菌群的组成和功能对肉鸡生产性能的影响。但是由于Omics技术过程复杂，费用昂贵，需要专业技能较强的操作分析人员，至今为止，并没有广泛应用于鉴定和定量肉鸡盲肠蛋白质水解细菌。在优化肉鸡饲养过程中最重要的变量之一的饲粮配方时，由于研究方法的差异性和几十年来用于鉴定肉鸡盲肠功能细菌方法的不可比较性，研究结果出现了可变性和无比较性。到目前为止，还没有一种有效、简便、容易操作的方法可以用来在原位状态下鉴定和定量肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，而肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的鉴定和定量可以间接用来监控肉鸡盲肠蛋白质发酵的水平，以便推测肉鸡盲肠蛋白质发酵对肉鸡生产健康和生产性能的影响,特别是对进一步优化不同的饲粮配方对肉鸡生产健康和生产性能的影响有着深远的意义。
技术实现思路
为了克服了现有的方法的不足，本专利技术提供一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，首先在原位状态下标定肉鸡盲肠蛋白质水解细菌，随后采用FISH(荧光原位杂交)回位鉴定肉鸡盲肠蛋白质水解细菌；最后通过DAPI染色回位定量肉鸡盲肠蛋白质水解细菌。可以快速获取肉鸡盲肠中的蛋白质水解细菌的组成和丰度的原位信息。本专利技术的具体方案如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、样品采集：随机抽取试验鸡，屠宰后剖开鸡腹截取盲肠，清洗，剪开肠壁，刮取食糜样品并存于小烧杯中；步骤（2）、稀释样品：称取大约10 g 步骤（1）的食糜样品，装入无菌过滤袋中，加入经预热的1×PBS缓冲液，混匀；步骤（3）、洗脱细胞：将步骤（2）混匀的液体转入到BioRad 匀浆袋中，在BioRad匀浆器高速档匀浆，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；步骤（4）、收集滤液：匀浆过程完成后，用无菌的单层纱布过滤食糜样品，滤液收集在无菌离心管中，离心；步骤（5）、收集沉淀物：去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于1×PBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，待用；步骤（6）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的标定取上述细胞悬浮液转入到血清瓶中，加1×Tris‑HCl缓冲液，再加入BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白BSA，随后加入电子传递链抑制剂，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动一段时间；将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取混合液涂布于用明胶涂层的载玻片上，避光风干；将上述风干的载玻片置于荧光显微镜载物台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光，记录每一个淀粉降解细菌的位置；步骤（7）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位鉴定清洗、干燥载玻片，采用寡聚核苷酸探针，使用FISH，在原位条件下回位鉴定肉鸡盲肠淀粉降解细菌，其中，寡聚核苷酸探针的5’末端采用Cy3染料标记，得到淀粉降解菌的位置；观察和拍照，根记录的淀粉降解细菌的位置回位到同一个视野下，通过Cy3激发快观察FISH染色图像，通过红色荧光激发块观察所有FISH染亮的细菌，被绿色荧光淀粉染亮的细菌同时又被寡聚核苷酸探针染亮说明以上述寡聚核苷酸探针为靶标的细菌具有在肉鸡盲肠中具有水解淀粉的功能；步骤（8）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位定量清洗、干燥载玻片，用取一定量的DAPI的染液覆盖于风干的载玻片上中央，将载玻片上的DAPI 染液均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色20‑30min，将染液倒去，并用蒸馏水小心冲洗2‑3遍，避光并在无菌操作箱中风干，即可在显微镜下镜检；将干燥好的载玻片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，根据上面步骤记录的蛋白质降解细菌的位置回到同一个视野下，通过DAPI激发快观察DAPI染色图像，通过兰色荧光激发块观察所有细菌；步骤（9）、盲肠蛋白质水解细菌的丰度的确定及统计分析。...

【技术特征摘要】
1.一种快速检测肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤（1）、样品采集：随机抽取试验鸡，屠宰后剖开鸡腹截取盲肠，清洗，剪开肠壁，刮取食糜样品并存于小烧杯中；步骤（2）、稀释样品：称取大约10g步骤（1）的食糜样品，装入无菌过滤袋中，加入经预热的1×PBS缓冲液，混匀；步骤（3）、洗脱细胞：将步骤（2）混匀的液体转入到BioRad匀浆袋中，在BioRad匀浆器高速档匀浆，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；步骤（4）、收集滤液：匀浆过程完成后，用无菌的单层纱布过滤食糜样品，滤液收集在无菌离心管中，离心；步骤（5）、收集沉淀物：去除上清液，并将沉淀物重新悬浮于1×PBS缓冲液中，得到细胞悬浮液，待用；步骤（6）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的标定取上述细胞悬浮液转入到血清瓶中，加1×Tris-HCl缓冲液，再加入BODIPY标记的绿色荧光小牛血清白蛋白BSA，随后加入电子传递链抑制剂，盖子盖好，并迅速用铝箔包严避光；将包裹好的血清瓶固定在旋转摇床上室温摇动一段时间；将血清瓶转移到暗室，打开血清瓶，吸取混合液涂布于用明胶涂层的载玻片上，避光风干；将上述风干的载玻片置于荧光显微镜载物台上100×的物镜下，通过绿色荧光激发块观察，淀粉降解细菌呈现绿色荧光，记录每一个淀粉降解细菌的位置；步骤（7）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位鉴定清洗、干燥载玻片，采用寡聚核苷酸探针，使用FISH，在原位条件下回位鉴定肉鸡盲肠淀粉降解细菌，其中，寡聚核苷酸探针的5’末端采用Cy3染料标记，得到淀粉降解菌的位置；观察和拍照，根记录的淀粉降解细菌的位置回位到同一个视野下，通过Cy3激发快观察FISH染色图像，通过红色荧光激发块观察所有FISH染亮的细菌，被绿色荧光淀粉染亮的细菌同时又被寡聚核苷酸探针染亮说明以上述寡聚核苷酸探针为靶标的细菌具有在肉鸡盲肠中具有水解淀粉的功能；步骤（8）、肉鸡盲肠蛋白质水解细菌的回位定量清洗、干燥载玻片，用取一定量的DAPI的染液覆盖于风干的载玻片上中央，将载玻片上的DAPI染液均匀涂开，并置于黑暗的无菌操作箱中染色20-30min，将染液倒去，并用蒸馏水小心冲洗2-3遍，避光并在无菌操作箱中风干，即可在显微镜下镜...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏云，孔云虹，瞿越云，赵亚南，念馨，张旭祥，段芳，
申请(专利权)人：夏云，
类型：发明
国别省市：云南,53