近红外第二窗口发射小分子稀土配合物荧光探针及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物材料技术领域，具体为近红外第二窗口发射小分子稀土金属配合物荧光探针及其制备方法。本发明专利技术荧光探针包括DOTA与稀土Ln(III)金属配位形成的配合物，DOTA‑NHS酯与稀土Ln(III)金属配位形成的配合物，以及Ln‑DOTA‑NHS与氨基PEG叶酸反应的产物。本发明专利技术通过改变大环多胺结构的官能团而不影响大环多胺与稀土离子的配位能力，与肿瘤表面的受体特异性结合后达到靶向肿瘤的效果，同时实现在近红外窗口指导下的手术切除。根据对小分子稀土配合物荧光探针化学修饰的供体类型，分子探针能够特异性地靶向各种肿瘤，实现抗体‑抗原的免疫反应，以及通过DNA序列的碱基对配对实现基因表达。

Near infrared second window emitting small molecule rare earth complex fluorescent probe and preparation method thereof

The invention belongs to the field of biomaterials technology, and specifically relates to a near infrared second window emitting small molecule rare earth metal complex fluorescent probe and a preparation method thereof. The fluorescent probe includes complexes formed by DOTA and rare earth Ln (III) metal coordination, complex of DOTA NHS ester and rare earth Ln (III) metal coordination, as well as the product of Ln DOTA DOTA NHS and amino PEG folic acid. By changing the functional groups of macrocyclic polyamines, it does not affect the coordination ability of macrocyclic polyamines and rare earth ions, and can achieve the target tumor after the specific binding of the receptors on the tumor surface, and the surgical excision under the guidance of the near infrared window is realized. According to the donor type of the fluorescent probe of the small molecule rare earth complexes, the molecular probe can specifically target various tumors, realize the immune response of the antibody antigen, and realize the gene expression by pairing the base pairs of the DNA sequence.

【技术实现步骤摘要】
近红外第二窗口发射小分子稀土配合物荧光探针及其制备方法
本专利技术属于生物材料
，具体涉及一种小分子稀土配合物荧光探针及其制备方法。
技术介绍
目前常见的分子影像技术如X-射线，断层扫描成像(CT)，磁共振成像(MRI)和超声成像(US)被用于辅助外科手术，但这些不是肿瘤特异性的，通常对手术应用效果并不理想。荧光成像由于实时、非侵入性、所需样品量少、高分辨率等优点，在生命科学和生物
等领域已经被广泛使用，尤其是具有靶向肿瘤特异性的荧光成像方式更具有一定的应用价值。在过去几年里，研究者们致力于研究近红外第一窗口(700nm～900nm)的荧光检测和成像，但是由于生物组织在这个波段范围内有很强的吸收和散射，致使其信噪比和组织穿透深度都比较低。因此，近期的一些研究工作主要集中在近红外第二窗口的光(1000nm～1700nm)，在这个波段，生物组织自身的吸收和散射弱，这样就可以极大地提高成像质量和穿透深度。目前，一些无机材料如碳纳米管，量子点，稀土纳米粒子和有机染料分子能够实现近红外第二窗口区的发射，但是它们的发射峰比较宽，进入活体后代谢缓慢，存在潜在的细胞毒性，在水中溶解性差，这大大限制了它们的应用价值。小分子稀土金属配合物也可以实现近红外第二窗口区的发射，并且具有斯托克斯位移大、锐线发射光谱、荧光寿命长、较高的发光效率、光漂白小、长期毒性低等优点，是用于深组织活体成像的一种很有前景的荧光探针。稀土离子独特的电子结构使其具有许多特殊的光谱性质。稀土离子由于f-f跃迁属于禁阻跃迁，其自身的光吸收能力很弱，摩尔消光系数很小。因此它们的发光主要是通过配体的敏化作用来实现的。目前的稀土配合物大多数是紫外可见光敏化的可见光发射的稀土配合物。因此，近红外光激发下的具有较高发光效率的稀土配合物将会是一种理想的深组织下活体成像和成像指导下的手术切除的荧光探针。通过改变大环结构的官能团而不影响大环多胺与稀土离子的配位能力，可以化学修饰上能够靶向肿瘤的供体，与肿瘤表面的受体特异性结合后达到靶向肿瘤的效果，同时实现在近红外窗口指导下的手术切除。根据对小分子稀土配合物荧光探针化学修饰的供体类型，分子探针能够特异性地靶向各种肿瘤，实现抗体-抗原的免疫反应以及通过DNA的碱基对配对实现基因表达。在临床生物分析和疾病检测方面有更广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备工艺简单、水溶性好、光稳定性高、肾清除快、可用于深组织近红外第二窗口发射的活体成像和成像指导下的手术切除的小分子稀土金属配合物荧光探针及其制备方法。本专利技术提供的近红外第二窗口发射的小分子稀土金属配合物荧光探针，是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)与稀土Ln(III)金属配位形成的配合物，记为Ln-DOTA，其结构通式如下：进一步，本专利技术提供的近红外第二窗口发射的小分子稀土金属配合物荧光探针，是DOTA衍生物DOTA-NHS酯与稀土Ln(III)金属配位形成的配合物，记为Ln-DOTA-NHS,其结构通式如下：进一步，本专利技术提供的近红外第二窗口发射的小分子稀土金属配合物荧光探针，是由上述的稀土配合物荧光探针Ln-DOTA-NHS与氨基PEG叶酸(NH2-PEG-FA)反应的产物，记为Ln-DOTA-FA，可作为靶向卵巢癌的近红外第二窗口发射的稀土配合物荧光探针，其结构通式如下：本专利技术中，所述稀土Ln(III)金属为氯化物，氯化物选自：NdCl3·6H2O，ErCl3·6H2O,TmCl3·6H2O，或HoCl3·6H2O。本专利技术提出的小分子稀土金属配合物荧光探针的制备方法，具体如下：(1)制备Ln-DOTA小分子稀土配合物荧光探针。称取1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)，放入单口圆底烧瓶中，用1～3ml的水溶解；然后称取稀土氯化物(稀土氯化物选自NdCl3·6H2O，ErCl3·6H2O，TmCl3·6H2O,HoCl3·6H2O)，用1～2ml的水溶解，将氯化物水溶液缓慢滴加到DOTA的水溶液中，室温搅拌；用NaOH溶液调节pH，使其在6.0～6.5之间；反应12～24小时，停止反应；缓慢加入无水乙醚或石油醚进行沉淀，静置，抽滤，得到对应的固体粉末，记为Ln-DOTA；DOTA与稀土氯化物的摩尔比为1:1～1:3，以1:1为最优条件。(2)制备Ln-DOTA-NHS小分子钕配合物荧光探针。称取DOTA衍生物DOTA-NHS酯(DOTA-NHS)放入单口圆底烧瓶中，用1～3ml的水溶解；然后称取稀土氯化物(稀土氯化物选自NdCl3·6H2O,ErCl3·6H2O,TmCl3·6H2O,HoCl3·6H2O)，用1～2ml的水溶解，将氯化物水溶液缓慢滴加到DOTA-NHS酯的水溶液中，室温搅拌；用NaOH溶液调节pH，使其在6.0～6.5之间；反应12～24小时，停止反应；缓慢加入无水乙醚或石油醚进行沉淀；静置，抽滤，得到白色固体，记为Ln-DOTA-NHS；DOTA-NHS酯与稀土氯化物的摩尔比为1:1～1:3，以1:1为最优条件。(3)制备Ln-DOTA-FA小分子钕配合物荧光探针。称取步骤(2)制备的固体，放入单口圆底烧瓶，加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温搅拌，然后称取氨基PEG叶酸(NH2-PEG-FA)，用1～2ml的水溶解，缓慢滴加到Ln-DOTA-NHS的溶液中，室温搅拌12～24小时后，停止反应，浓缩反应液，用无水乙醚或石油醚洗涤数次，得到黄色固体，即为所需Ln-DOTA-FA小分子钕配合物荧光探针。其中，N,N-二异丙基乙胺和N,N-二甲基甲酰胺的质量比例为1:8～1:10，优选1:9。本专利技术中，以小分子稀土配合物荧光探针分子Nd-DOTA为例，在水溶液中，在740nm和802nm处有较强的吸收，进一步用808nm的激光器激发，能够观察到稀土钕离子在1060nm和1330nm处的荧光发射峰(图1)。本专利技术中，以小分子稀土配合物荧光探针分子Nd-DOTA为例，在水溶液中1060nm处的荧光寿命为5.37μs。本专利技术中，以小分子稀土配合物荧光探针分子Nd-DOTA为例，在水溶液中的荧光量子产率为0.3％。本专利技术中，以小分子稀土配合物荧光探针分子Nd-DOTA为例，在808nm激光器的激发下，分别在水溶液、PBS缓冲溶液和老鼠血液中，2小时内光稳定性保持不变(图2)。本专利技术中，以小分子稀土配合物荧光探针分子Nd-DOTA为例，当浓度在500μg/ml时，细胞存活率仍然在95％以上(图3)。本专利技术通过改变大环多胺结构的官能团而不影响大环多胺与稀土离子的配位能力，可以化学修饰上能够靶向肿瘤的供体，进而与肿瘤表面的受体特异性结合后达到靶向肿瘤的效果，同时实现在近红外窗口指导下的手术切除。根据对小分子稀土配合物荧光探针化学修饰的供体类型，分子探针能够特异性地靶向各种肿瘤，实现抗体-抗原的免疫反应以及通过DNA序列的碱基对配对实现基因表达。在临床生物分析和疾病检测方面有更广阔的应用前景。本专利技术中与稀土金属配位的配体也适用于商业化并应用于临床上的MRI磁共振造影剂的其余5种配体：DOTA的衍生物DO3A-butrol和HP-D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种近红外第二窗口发射的稀土配合物荧光探针，其特征在于，为1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑1,4,7,10‑四乙酸(DOTA)与稀土Ln(III)金属配位形成的配合物，记为Ln‑DOTA，其结构通式如下：

【技术特征摘要】
1.一种近红外第二窗口发射的稀土配合物荧光探针，其特征在于，为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)与稀土Ln(III)金属配位形成的配合物，记为Ln-DOTA，其结构通式如下：或者为DOTA衍生物DOTA-NHS酯与稀土Ln(III)金属配位形成的配合物，记为Ln-DOTA-NHS,其结构通式如下：或者为所述稀土配合物荧光探针Ln-DOTA-NHS与氨基PEG叶酸反应的产物，其结构通式如下：2.根据权利要求1所述的近红外第二窗口发射的稀土配合物荧光探针，其特征在于，所述稀土Ln(III)金属为氯化物，选自：NdCl3·6H2O,ErCl3·6H2O,TmCl3·6H2O,HoCl3·6H2O。3.一种如权利要求1所述的近红外第二窗口发射的稀土配合物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述Ln-DOTA制备的具体步骤如下：称取1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)，放入单口圆底烧瓶中，用1～3ml的水溶解；然后称取稀土氯化物，稀土氯化物选自NdCl3·6H2O，ErCl3·6H2O，TmCl3·6H2O,HoCl3·6H2O，用1～2ml的水溶解，将氯化物水溶液缓慢滴加到DOTA的水溶液中，室温搅拌；用NaOH溶液调节pH，使其在6.0～6.5之间；反应12～24小时后，停止反应；缓慢加入无...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凡，杨燕玲，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31