一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记、引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记、引物及其应用，该分子标记为T↔G颠换类型。依据该分子标记开发了扩增引物及SNP基因芯片，实现了苹果砧木个体抗寒性性状的早期鉴定。本发明专利技术这一SNP分子标记和SNP基因芯片可以实现苹果砧木抗寒性的快速、准确的鉴定，降低了苹果砧木杂种苗选育的时间和经济成本。本发明专利技术为苹果砧木抗寒分子标记辅助育种提供了标记资源，为利用基因工程手段培育抗寒新种质奠定了基础，具有重要的理论意义和实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记、引物及其应用
本专利技术涉及一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP（单核苷酸多态性）分子标记及其引物，还涉及一种SNP基因芯片及快速鉴定苹果砧木抗寒性的方法，属于作物遗传育种

技术介绍
由于气候异常导致极端天气频现，对农业生产造成较大影响，其中低温成为制约我国农业生产效益的一个重要环境因子。低温导致的冷害和冻害等非生物胁迫是影响植物生长发育和繁殖的主要限制因素。在植物育种过程中，需要将抗低温胁迫能力作为重要指标，用以评价、衡量新种质生产应用的价值和潜力。传统育种中，针对实生后代多采用生理生化或逆境胁迫下的表型评价，淘汰不符合抗寒育种目标的个体，具有测试条件要求高、处理过程繁杂、准确性差、工作量大、效率低等缺点，对于苹果等多年生木本作物，个体大、不易移动，育种实践中对其抗寒性准确评价难以实现，获得抗性新品种的周期长。为适应低温胁迫，植物在分子水平上进化形成了相应的机制，诱导胁迫相关基因的表达，进一步调控不同的复杂信号通路，调控下游生理生化变化，如活性氧清除、渗透势调节、生物膜保护等生物学过程来抵御逆境。通过鉴定筛选与抗寒性表型遗传控制位点紧密连锁的分子遗传标记，可以实现通过分子标记方法鉴别实生后代抗寒性的高低，极大提高育种中早期选择的工作效率，缩短育种时间。目前随着植物基因组测序的发展，基于遗传图谱的数量性状定位研究技术方兴未艾，对于解析和开发关键表型背后的分子标记提供了一条新的研究途径。依据这一策略国内外已鉴定到多个与苹果果实品质、抗病性、矮化性等相关或连锁的分子标记。这些标记中少数开始用于辅助育种阶段，例如欧洲育种计划中，开发出4个抗黑星病标记（3SSR和1SCAR），2个抗白粉病标记（1SSR和1SCAR），2个抗火疫病标记（SCAR），利用这些标记从9个杂交组合的1041株后代中筛选出25株抗病株系，可以作为下一步培育抗病品种的亲本。但目前关于抗非生物逆境（寒冷、干旱、盐、碱等）连锁标记开发还较少，分子辅助选择或分子辅助育种工作还处于相对滞后的阶段。矮砧集约栽培是当前苹果的主要趋势，优良矮化砧木是实现集约栽培的基础。国外矮砧育种开展较早，如英国利用杂交等技术育成M系、MM系等矮化砧木，对促进世界苹果栽培变革发挥了重要作用。此外，美国、加拿大、日本、波兰、前苏联等国家利用杂交、实生、诱变等技术，育成G系、MAC系、O系、JM系、B系等抗病、抗虫或抗重茬矮化砧木。我国砧木育种开展较晚，育种成果主要为通过常规杂交育成的矮化砧木SH系和GM256。根据当前我国苹果产业发展需求，急需自主选育抗性和适应性强、矮化性好、易繁殖、综合性状优良的矮化砧木。但目前通过常规育种获得新品种周期长，而通过分子辅助技术获得抗逆新品种日益受到重视，其中开发连锁标记是这一工作的前提。
技术实现思路
针对筛选苹果抗寒性新种周期长的不足，本专利技术提供了一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记，以达到为苹果抗寒性砧木分子辅助育种提供标记的目的。本专利技术还提供了扩增该SNP分子标记的PCR引物以及含有该引物的SNP基因芯片，通过该引物和基因芯片，能够快速的筛选出苹果抗寒株系，提高了育种的效率。本专利技术还提供了快速鉴定苹果砧木抗寒性的方法，该方法操作便捷，效率高，耗时短，为苹果抗寒性新种的培育提供了有利的技术支持。本专利技术利用抗寒性较强的苹果砧木“60-160”（低温半致死温度-37.42C°）与不抗寒矮化砧木“M9”（低温半致死温度-30.05C°）构建的杂交群体200株系和简化基因组测序（RAD-seq）技术，构建高密度遗传图谱。评价图谱构建群体的梯度降温（0～-40℃）条件下枝条相对电导率，求得各株系低温半致死温度（LethalTemperature，LT50）。利用构建遗传图谱，开展此低温半致死温度的数量性状位点（QTLs）定位，鉴定获得年份间稳定存在、与性状连锁性强的SNP遗传标记。根据株系测序结果，确认该SNP遗传标记为位于苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基，为颠换类型：T↔G。即本专利技术苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记（简称SNP分子标记，下同）位于苹果参考基因组第4号染色体上，该苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基上存在一个T/G颠换类型单核苷酸多态性变异。从LT50结果看，当第4519417号碱基处为TT基因型时，株系的LT50表型值低，表示半致死温度更低，抗寒性更强，为GG基因型时，株系的LT50表型值高，表示半致死温度更高，抗寒性更弱，为TG基因型时，半致死温度介于GG基因型和TT基因型之间，抗寒性也介于这两者之间。因此，通过检测该4519417号碱基处的基因型，可以直接从分子层面获得株系的抗寒性能。进一步的，为了更方便的通过扩增的方式获取第4519417号碱基处的基因型，将该碱基物理位置上下游各50bp碱基的该段碱基序列作为SNP分子标记，该SNP分子标记的碱基序列为：TAACTCTAGGGTTGCAACCAGTGTTTGATAAGATATTTAATAATTGTGCCT/GTCAGATGAAGCTTAATAAAGCATCTCTTTTCTTGGGCTTCGATGTTTTTA，如SEQIDNO:1所示，在该碱基序列的第51位碱基处存在一个T/G颠换类型单核苷酸多态性变异（T/G等位基因），为51T或51G。进一步，本专利技术还提供了用于扩增SEQIDNO:1所示的碱基序列的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记的PCR引物，该引物可用于竞争性等位基因特异性PCR扩增，该引物如下：T等位基因引物（Primer_Allele）：5’AAAGAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAA3’，如SEQIDNO:2所示；G等位基因引物（Primer_Allele）：5’GAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAC3’，如SEQIDNO:3所示；通用引物（Primer_Common）：5’GGGTTGCAACCAGTGTTTGATAAGATATT3’，如SEQIDNO:4所示。进一步的，上述T等位基因引物和G等位基因引物上都带有荧光标记，但这两种引物上带有的荧光标记种类不同。荧光标记可以是现有技术中常用的荧光标记，例如FAM荧光标记、HEX荧光标记。本专利技术还提供了一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片（简称SNP基因芯片），该SNP基因芯片上固定有上述苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记的PCR引物，引物共三种。利用该SNP基因芯片可以实现苹果砧木抗寒性的快速、准确的鉴定。本专利技术的SNP分子标记和SNP基因芯片可以用于苹果育种中，用来筛选抗寒的苹果砧木杂交后代个体。SNP分子标记和SNP基因芯片的使用提供了一种分子辅助育种的新方式，使苹果抗寒性新种的快速筛选成为了可能。本专利技术SNP分子标记、苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片在苹果育种中的应用也在保护范围之内。本专利技术还提供了一种快速鉴定苹果砧木抗寒性的方法，该方法包括以下步骤：（1）提取苹果基因组DNA，以该DNA为模板，在苹果砧木抗寒性鉴定的SNP基因芯片上进行竞争性等位基因特异性PCR反应；（2）PCR扩增结束后，将SNP基因芯片进行分析，根据SNP分子标记的基因型判断苹果砧木抗寒性的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记，其特征是：该SNP分子标记位于苹果参考基因组第4号染色体上，该苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基上存在一个T/G颠换类型单核苷酸多态性变异。

【技术特征摘要】
1.一种苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记，其特征是：该SNP分子标记位于苹果参考基因组第4号染色体上，该苹果参考基因组第4号染色体正链方向的第4519417号碱基上存在一个T/G颠换类型单核苷酸多态性变异。2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征是：其碱基序列如SEQIDNO:1所示，在该碱基序列的第51位碱基处存在一个T/G颠换类型单核苷酸多态性变异，为51T或51G。3.用于扩增权利要求2所述的苹果砧木抗寒性鉴定的SNP分子标记的PCR引物，其特征是：T等位基因引物：5’AAAGAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAA3’；G等位基因引物：5’GAGATGCTTTATTAAGCTTCATCTGAC3’；通用引物：5’GGGTTGCAACCAGTGTTTGATAAGATATT3’。4.根据权利要求3所述的PCR引物，其特征是：T等位基因引物和G等位基因引物上均带有荧光标记，这两种引物上的荧光标记不同。5.一种苹果...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海波，李林光，程来亮，常源升，孙家正，何平，李慧峰，
申请(专利权)人：山东省果树研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37