本发明专利技术公开了一种检测细胞衰老的方法，将染料食品红104(英文名Phloxin B，CAS：18472‑87‑2)结合到待检测细胞中，形成细胞‑‑染料复合物，加以检测。包括以下步骤：a)染料储液制备：将Phloxin B配制成1mg/ml的储液；b)细胞培养：将裂殖酵母菌株活化接种于YES平板，培养2‑3天后制备饱和过夜培养液，取菌液稀释于液体YES培养基中培养；c)细胞‑‑染料复合物制备：细胞培养到指定时间点，取菌液加入Phloxin B染料，避光染色细胞；d)细胞‑‑染料复合物检测：将染色后的细胞用PBS洗3次后，荧光显微镜下观察，统计死活细胞比例，得出存活率。本发明专利技术方法具有工艺简单、检测成本低、检测效率高等优点。
【技术实现步骤摘要】
一种检测细胞衰老的方法
：本专利技术属于生命科学应用领域，是一种衰老检测新方法。尤其是一种荧光染料食品红104(英文名PhloxinB)结合到待检测裂殖酵母细胞中，形成细胞--染料复合物，加以检测。
技术介绍
：酵母细胞有多种类型，包括芽殖酵母(Saccharomycescerevisiae)，裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)。在过去的十几年里，酵母作为模式生物在衰老研究中发挥重要作用，其中芽殖酵母作为研究的先驱者对阐明一系列重要分子机制，理解细胞衰老，以及发现新的长寿基因十分有用，它已经被证明，无论是在研究复制寿命上还是时序寿命上，均是一个非常重要的模式生物，人们已经利用它发现了许多衰老相关机制(包括衰老相关基因及相关信号通路)。更重要的是，这些基因被多次证明在多细胞真核生物中是保守的。芽殖酵母作为已经建立的研究衰老的一个理想的模式生物，其具有众多优点：(1)生活周期短，易于培养；(2)遗传背景清楚，酵母作为第一个基因组被测定的真核模式生物，有相对完整的基因组数据库；(3)有充分的遗传学操作方法和手段，易于做遗传学分析。裂殖酵母是最近新出现的一个用于衰老研究的十分有用的杆状单细胞真核生物，无论是形态学上还是遗传学上，均与现在普遍使用的芽殖酵母有很大的不同。相较于芽殖酵母，它有许多独特的优势。它与哺乳动物共享着一些在芽殖酵母中没有的过程，包括RNAi干扰机制、核结构蛋白和染色质结合蛋白以及着丝粒结合蛋白、mRNA剪接机制、线粒体基因组对生存的需求。所以，裂殖酵母作为一个独特的模式系统可以用来发现新的长寿调控途径，同时兼具芽殖酵母的优点，如便捷的基因组修改和大批量的生长和分析。此外，在裂殖酵母中Wis4/Wis1/Sty1压力响应通路是依赖于mitogen-activatedprotein(MAP)kinases，这类似于哺乳动物压力响应激活MAPkinasesp38和JNK。裂殖酵母与芽殖酵母亲缘关系较远，进化上更接近于人类，拥有许多与人类同源的基因，这为研究人类疾病和衰老的分子机制提供了一些优势。目前，相对于复制寿命，酵母时序寿命研究得较多，其测定方法一般有以下几种：1)克隆计数法(CloningFormingUnits，CFU)：酵母细胞进入稳定期后，因培养基中营养耗尽而停止生长，以不分裂状态存在并存活一段时间，当给予营养以后能够再次生长，依据酵母细胞在稳定期的存活能力以及再次涂布在平板上形成的菌落数，并基于对稳定期第一天的菌落数(稳定期第一天的成活率定义为100％)，可以计算出酵母细胞的存活率。此方法步骤繁琐，涂布平板时不同培养天数菌液稀释倍数不同使得平板上的菌落长得太多或太少，影响测定结果。同时这种方法需要消耗大量固体平板和EP管等耗材；2)点分析法(SpotAssay)：此方法虽较为简单，只需要将菌液做梯度稀释(通常做5个梯度浓度，每个浓度相差10倍)，点相同体积于平板上，观察细胞生长情况，此方法可以通过目测方法初步比较酵母细胞的寿命长短情况，但不能定量测定和分析细胞存活率；3)染色法：染色法是最近新出现的一种寿命测定方法，如通过荧光染料PI(PropidiumIodide)可以将死细胞染色而不能染色活细胞，或将死活细胞染成不同颜色的方法，计算死活细胞比例来测定存活率的方法，使用染料染色细胞后，通过荧光显微镜或流式细胞仪可以测定细胞的存活率。此方法操作简便，可准确分析出细胞存活率。但有些染料价格昂贵，限制了其应用。
技术实现思路
：鉴于现有技术的以上不足，本专利技术的目的是提供一种简便、廉价的寿命检测方法，并使其具有检测效率高、耗时短等优点。本专利技术的目的是通过如下的手段实现的。一种检测细胞寿命的方法，将染料PhloxinB结合到待检测裂殖酵母细胞中，形成细胞--染料复合物，加以检测。包括以下步骤：a)步骤包含如下具体工艺：从泰坦科技股份有限公司购买进口分装染料PhloxinB固体粉末，包装为5G/瓶，品牌Acros，取20mg加入到20ml双蒸馏水中，充分溶解混匀，配制成1mg/ml的储液，储液呈红色；b)步骤包含如下具体工艺：从-80℃低温冰箱中取出所需的裂殖酵母菌株，接种于YES平板中，30℃培养2-3天，(附：YES培养基成分为：葡萄糖30g/L；酵母提取物5g/L；组氨酸，丝氨酸，亮氨酸，尿嘧啶，腺嘌呤各225mg/L，YES固体平板需加20g/L琼脂，YES液体培养基不加琼脂)；挑取3-4个菌落于装有2.5mlYES的带棉塞的大号试管中培养过夜(大号试管型号为20mm×20cm)；稀释饱和过夜培养液到盛有25ml已灭菌的YES液体培养基的150ml三角瓶中，保证起始浓度为1×105cells/ml，即起始OD600＝0.01；2天后(即培养48h后)记为CLSDay1(CLSDay1存活率定义为100％)，开始检测存活率；c)步骤包含如下具体工艺：在超净工作台中，取已灭菌1.5mlEP管加入900ul无菌水，再从三角瓶中用移液器吸出100ul细胞培养液于900ul无菌水中，即将培养液稀释10倍，用分光光度计测定稀释后的菌液OD600，取0.5OD600的菌液5000rpm离心3min获得细胞，用无菌水洗涤细胞一次后加入1ml无菌水，加入1mg/ml的PhloxinB储液，使其终浓度为5μg/l；于30℃摇床避光温育染色2h；d)步骤包含如下具体工艺：用1×PBS(137mMNaCl，2.7mMKCl，100mMNa2HPO4，2mMKH2PO4，pH7.4)将细胞洗涤3次，将细胞混匀后用移液器吸取7μl于载玻片上，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下，荧光显微镜型号OLYMPOSIX71，于绿色激发光下激发红色荧光，拍照，红色细胞即为死细胞。同时在白色光场视野下拍照，白色光场下的细胞为总细胞数，包含死活细胞，统计死活细胞比例，得出存活率。采用本专利技术方法，具有工艺简单、检测成本低、检测效率高等优点。具体实施方式：实施例1：加热灭活细胞的寿命检测将细胞培养至对数生长期，即培养24h左右，采用恒温水浴锅加热的方法，65℃热处理1h，使细胞全部死亡，加入PhloxinB染料，避光处理2h后，用PBS洗3次，荧光显微镜下观察，检测热灭活细胞存活率。实施例2：生长期(未衰老期)细胞寿命的检测将细胞培养至稳定期，即培养48h左右，取0.5OD600的菌液，加入PhloxinB染料，避光处理2h后，用PBS洗3次，荧光显微镜下观察，检测生长期细胞的存活率。实施例3：衰老期细胞寿命的检测将细胞培养至衰老期，即CLSDay4，CLSDay5，CLSDay7，CLSDay14，CLSDay17，取0.5OD600的菌液，加入PhloxinB染料，避光处理2h后，用PBS洗3次，荧光显微镜下观察，检测衰老期细胞存活率。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测细胞衰老的方法，将染料食品红104(英文名Phloxin B，CAS：18472‑87‑2)结合到待检测裂殖酵母细胞中，形成细胞‑‑染料复合物，加以检测。包括以下步骤：a)染料储液制备：将染料Phloxin B固体粉末配制成1mg/ml的储液；b)细胞培养：将待检测的裂殖酵母菌株活化后，接种于2.5ml YES液体培养基中，制备饱和过夜培养液，测定其OD600，取一定菌液稀释到装有新鲜YES液体培养基的三角瓶中，使其起始浓度为1×10
【技术特征摘要】
1.一种检测细胞衰老的方法，将染料食品红104(英文名PhloxinB，CAS：18472-87-2)结合到待检测裂殖酵母细胞中，形成细胞--染料复合物，加以检测。包括以下步骤：a)染料储液制备：将染料PhloxinB固体粉末配制成1mg/ml的储液；b)细胞培养：将待检测的裂殖酵母菌株活化后，接种于2.5mlYES液体培养基中，制备饱和过夜培养液，测定其OD600，取一定菌液稀释到装有新鲜YES液体培养基的三角瓶中，使其起始浓度为1×105cells/ml，即A600＝0.01，30℃恒温培养，摇床转速220rpm；c)细胞--染料复合物制备：在一定时间点测定细胞存活率，取菌液测定其OD600，取0.5OD600的菌液，离心，用无菌水洗涤细胞一次，加入PhloxinB，避光染色细胞2h；d)细胞--染料复合物检测：用PBS洗涤细胞3次后，将细胞置于载玻片上，荧光显微镜下检测细胞存活率。2.根据权利要求1所述之检测细胞寿命的新方法，其特征在于，所述a)步骤包含如下具体工艺：从泰坦科技股份有限公司购买进口分装染料PhloxinB固体粉末，包装为5G/瓶，品牌Acros，取20mg加入到20ml双蒸馏水中，充分溶解混匀，配制成1mg/ml的储液，储液呈红色；b)步骤包含如下具体工艺：从-80℃低温冰箱中取出所需的裂殖酵母菌株，接种于YES平板中，30℃培养2-3天，(附：YES培养基成分为：葡萄糖30g/L；酵母提取物5g/L；组氨酸，丝氨酸，亮氨酸，...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄新河，
申请(专利权)人：成都汉凰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51
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