一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物及扩增、克隆和测序方法技术

本发明专利技术公开了一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物及扩增、克隆和测序方法，属于生物技术领域，本发明专利技术采用6组扩增嵌套引物对白顶溪鸲线粒体控制区进行2次PCR扩增，第一轮PCR的产物可直接进行测序，第二轮PCR扩增出的片段结合琼脂糖凝胶回收纯化快速克隆技术可以大大提高测序模板的纯度和浓度，以消除测序过程中的异质性，有效攻克了多聚核苷酸序列导致测序失败的难题，直接测序结合克隆测序大大减轻了操作者的工作负担，本发明专利技术采用扩增嵌套引物二级结构少，构象稳定，6种嵌套引物的3’末端均避免了A碱基的引入从而大大降低非特异性扩增的风险。

A nested primer and amplification, cloning and sequencing method for mitochondrial control region of Robin

The invention discloses a nested primer and amplification, cloning and sequencing method for the mitochondrial control area of white top Creek robins, which belongs to the field of biological technology. The invention adopts 6 sets of amplified nested primers for 2 PCR amplification of the mitochondrial control area of white top Creek robins, and the products of the first round of PCR can be directly sequenced and second round PCR expanded. The rapid cloning technology with agarose gel recovery and purification can greatly improve the purity and concentration of the sequencing template, so as to eliminate the heterogeneity in the sequencing process and effectively overcome the problem of the failure of the sequence of polynucleotides. Direct sequencing and cloned sequencing greatly reduce the workload of the operator. This invention is used in this invention. The two stage structure of the amplified nested primers was less and the conformation was stable. The 3 'end of the 6 nested primers avoided the introduction of A base and thus greatly reduced the risk of nonspecific amplification.

【技术实现步骤摘要】
一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物及扩增、克隆和测序方法
本专利技术属于生物
，涉及扩增、克隆
，具体涉及一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物及扩增、克隆和测序方法。
技术介绍
白顶溪鸲(Chaimarrornisleucocephalus)作为一种重要的野生鸟类，分布范围广，通过分子手段对其生物多样性进行研究有利于指导白顶溪鸲野生资源的保护。白顶溪鸲在分类学上属于雀形目鹟科，其种类繁多、形态多样、分布广泛；关于该科各属间或属内的鸟类的系统发育关系存在着较大的争议。相对于核基因组而言，鸟类线粒体基因组在进行系统发育分析时具有如下优势：分子量小、基因排列紧密、严格的母系遗传、无组织特异性和进化速率快等，因此，线粒体DNA已被广泛作为分子标记用于鸟类系统发育关系的研究。其中线粒体控制区(controlregion)，又称D-loop，是线粒体基因组中最长的非编码区域，对线粒体DNA的复制和转录起始进行调控。由于线粒体控制区序列变化较大，可以作为群体遗传学理想的分子标记去研究白顶溪鸲的种群特征。白顶溪鸲的线粒体控制区中存在大量多聚核苷酸串联重复序列，在DNA的测序过程中，测序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物，其特征在于，所述的扩增嵌套引物包括SEQ ID NO.1‑6所示的特异性嵌套引物，其中，SEQ ID NO.1：ATCTCCAACTCCCAAAGCT；SEQ ID NO.2：CAAACTGGGATTAGATACC；SEQ ID NO.3：TCTCACGAGAACCGAGCTAC；SEQ ID NO.4：ATCTTCCTCTTGACATGTCC；SEQ ID NO.5：GGTATTTTCAACTAAACTACTT；SEQ ID NO.6：AGGGTATGTACTCTCTGCATCG。

【技术特征摘要】
1.一种白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物，其特征在于，所述的扩增嵌套引物包括SEQIDNO.1-6所示的特异性嵌套引物，其中，SEQIDNO.1：ATCTCCAACTCCCAAAGCT；SEQIDNO.2：CAAACTGGGATTAGATACC；SEQIDNO.3：TCTCACGAGAACCGAGCTAC；SEQIDNO.4：ATCTTCCTCTTGACATGTCC；SEQIDNO.5：GGTATTTTCAACTAAACTACTT；SEQIDNO.6：AGGGTATGTACTCTCTGCATCG。2.根据权利要求1所述的白顶溪鸲线粒体控制区扩增嵌套引物，其特征在于，所述扩增嵌套引物由通用生物系统有限公司安徽厂合成，浓度为5μmol。3.一种采用权利要求1-2任一所述扩增嵌套引物扩增白顶溪鸲线粒体控制区的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)样品取材：取白顶溪鸲的肌肉，编号K0017；2)提取基因：采用酚、氯仿抽提法进行总基因提取，将编号K0017的肌肉组织剪碎后置于灭菌的EP管内，并向EP管加入DNA提取液及RNaseA，摇匀在温度37℃下水浴1h；再加入蛋白酶K，摇匀置于50℃水浴至肌肉完全消化；冷却至室温加入等体积的饱和酚，摇荡至水相与酚相混合成乳状液；离心分离，取上层水相重复酚提取1-2次；向酚提取的溶液中加入等体积的氯仿异戊醇，摇荡均匀，离心分离，然后将上层水相重复氯仿提取操作1次后再取上层水相并加入1/5体积的NaAC及2倍体积预冷的无水乙醇，室温轻摇置于-20℃冰柜中冷冻3h；然后离心15min，除上清液后，循环乙醇漂洗，离心15min操作2次，风干离心物，向离心物加入1×TE溶解DNA，将溶解液置于-40℃冰柜中储存，并取DNA溶解液进行琼脂糖凝胶电泳；3)两次PCR扩增：第一次PRC扩增，向EP管加入Dream-taqbuffer、扩增嵌套引物1、dNTPMix、Dream-Taq酶、提取的DNA、二甲基亚砜和双蒸水，然后在94℃预变性3min；然后进行36个循环，该循环包括：94℃变性30s，退火和延伸；最后再作72℃延伸8min，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，将扩增产物和对应的扩增引物进行测序，其中，扩增嵌套引物1一组为No.1和No.4引物，产物编号B1-a，一组为No.2和No.3引物，产物编号B1-b，每组各重复扩增3次；第二次PCR扩增：向EP管加入Dream-taqbuffer、扩增嵌套引物2、dNTPMix、Dream-Taq酶、第一次PCR扩增产物B1-a、二甲基亚砜和双蒸水,然后在94℃预变性3min；然后进行36个循环，该循环包括：94℃变性30s，退火和延伸；最后再作72℃延伸8min，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，其中，扩增嵌套引物2为No.5和No.6引物，产物编号B2，重复扩增3次。4.根据权利要求3所述的扩增嵌套引物扩增白顶溪鸲线粒体控制区...

【专利技术属性】
技术研发人员：阚显照，丁恒武，董锦绣，蒋澜，王青青，吴璇，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34