一种通过PCR技术评估土豆辐照剂量的方法技术

本发明专利技术提供一种通过PCR技术评估土豆辐照剂量的方法，该方法首先通过梯度剂量辐照处理未辐照土豆，提取样本总DNA模板，并使用2对鉴别引物(P1，P2)进行定量PCR的Livak分析，构建“辐照剂量——初始循环数差值的指数函数”的标准曲线。使用相同PCR方法检测待测样本并获得样本初始循环数CT值，通过已构建标准曲线推导出对应的辐照剂量，从而实现对土豆的定量辐照鉴定。相较于现行的“彗星DNA法”，本发明专利技术可提高食品辐照鉴定的结果准确性，降低检测方法实现成本，对辐照食品生产和辐照加工企业的质量安全控制、食品安全监督部门、进出口检验检疫部门食品辐照鉴定业务均有重要的应用价值。

A method of evaluating potato radiation dose by PCR Technology

The present invention provides a method for evaluating the irradiated dose of Potato by PCR technology. The method first irradiated the unirradiated potato through the gradient dose irradiation, extracted the sample total DNA template, and used 2 differential primers (P1, P2) to carry out quantitative PCR Livak analysis to construct the \radiation dose the index function of the difference value of the initial cycle number\. Standard curve. The sample was detected by the same PCR method and the initial cycle number CT of the sample was obtained. The corresponding irradiation dose was derived through the established standard curve, thus the quantitative irradiation identification of potatoes was achieved. Compared with the current \comet DNA method\, the invention can improve the accuracy of the results of food irradiation identification and reduce the cost of detection methods. It has an important application price for the quality and safety control of irradiated food production and radiation processing enterprises, food safety supervision department and the food irradiation identification service of import and export inspection and quarantine department. Value.

【技术实现步骤摘要】
一种通过PCR技术评估土豆辐照剂量的方法
本专利技术涉及食品辐照检测
，特别涉及一种通过PCR技术评估土豆辐照剂量的方法。
技术介绍
辐照食品鉴定是检验食品是否接受辐照、以及辐照剂量是否符合安全标准的多种方法的统称，是辐照加工企业日常控制产品质量、食品生产企业、食品卫生监督部门及检验检疫部门检测辐照食品(果蔬类、肉制品、水产品等)的质量安全、辐照加工、检验检疫的重要环节。通过定量辐照鉴定，可对辐照剂量不足或过度辐照的食品进行排查，增加辐照食品安全性，提升消费者的接受程度。现行国标“彗星DNA法”(GB23748-2016)的辐照鉴定方法源自欧洲标准委员会标准EN13.784(CEN，2001)，该方法用于检测电离辐射导致的DNA损伤，检测原理基于辐照导致的DNA双链断裂(DSB，doublestringbreak)，根据单细胞电泳图像结果可进行样本筛选：若阳极方向出现彗星状核酸拖尾，可能为辐照样本，需进一步确定；阳极方向若无彗星状核酸拖尾，判断为未辐照样本。该方法不适用于反复冻融及长期保存的食物，且只能用于样品辅助筛选，且无定量鉴定功能。为实现定量辐照鉴定功能，近年来研究者使用了多种新技术，如电子自旋共振(ElectronSpinResonance，ESR)、热释光(Thermoluminescence，TL)、光释光(OpticallyStimulatedLuminescence，OSL)、二氢脱氧胸腺嘧啶(DiHT)等方法，其共同特征均是量化评估辐照产生的其他物理或化学效应，最终推导获得对应剂量结果。而在基于DNA损伤原理的辐照鉴定方法中，最近的报道中仍使用RAPD-PCR法和彗星DNA法，并根据图像观测结果进行判定，未建立辐照DNA损伤的量化评估方法，因此结果稳定性和精确性表现不佳。如能突破该量化评估体系，一是可提高“DNA变异法”的鉴定结果精确度；二是相对于ESR法、TL法、OSL法等检测技术(需要高价格仪器或大型辐射防护设施)，可大幅度节约仪器成本或辐照防护成本。由于生鲜食品中DNA核酸含量充裕，固定物种总DNA中特定片段间的分布状态相对稳定，根据DNA变异进行定量辐照鉴定的技术可行性较高。综合以上情况，构建一种用于辐照定量鉴定的DNA损伤量化评估方法，有必要且可行性较高。
技术实现思路
本专利技术旨在解决现有“彗星DNA法”结果稳定性和精确性表现不佳的问题，提供一种通过PCR技术评估土豆辐照剂量的方法，该方法以土豆总DNA中两个特定片段间的倍数关系为分析对象，通过分析“辐照剂量——初始循环数”之间的函数关系，构建标准曲线，最终实现对辐照DNA损伤的量化评估。实现辐照鉴定定量功能，提高结果精确性。为解决上述技术问题，本专利技术通过以下技术方案实现：一种通过PCR技术评估土豆辐照剂量的方法，包括下述步骤：A、构建“辐照剂量——初始循环数差值的指数函数值”标准曲线取同批未辐照土豆若干，按一定梯度剂量进行辐照处理，根据剂量瓶结果记录辐照剂量，提取各样本的总DNA，提取得到的总DNA模板采用引物对组合P1-P2进行实时定量PCR检测，通过Livak分析,得到各样本的初始循环数值；然后以辐照剂量的对数值为纵轴，以引物对P2与引物对P1实时定量PCR检测得到的始循环数的差值的指数函数值为横轴进行线性回归，构建得“辐照剂量——初始循环数差值的指数函数值”标准曲线；在该步骤中，若用D表示辐照剂量，用CT表示初始循环数，用△CT表示初始循环数差值，则初始循环数差值的指数函数值X计算公式如下:X＝2^(△CTD(P1，P2))＝2^(CTD(P2)-CTD(P1))；标准曲线公式如下：D＝K*X+N，其中X为初始循环数差值的指数函数值，K为斜率，N为常数；B、获取待检土豆样本的初始循环数差值的指数函数值提取待检土豆样本总DNA模板至少3个，按照步骤A进行实时定量PCR检测，通过Livak分析，分别得到待检土豆样本采用引物对P2得到的初始循环数值及采用引物对P1到的初始循环数值，引物对P2得到的初始循环数值减去引物对P1得到的初始循环数值即得待检土豆样本初始循环数差值；以2为底数，以待检土豆样本初始循环数差值为指数，计算待检土豆样本的初始循环数差值的指数函数值；在该步骤操作中，应保证得到的P1及P2的初始循环数值均大于15并小于35，如不在该范围内，应调节检测体系模板量，使15<初始循环数值<35；C、将步骤B得到的待检土豆样本初始循环数差值的指数函数值带入步骤A的标准曲线，推导得到对应的辐照剂量并计算平均值即得待测样本辐照剂量；其中，所述引物对组合P1-P2序列为：P1：5’ATTCGGCCTAGCTCTGTGAC3’5’TGAGATGCCCAACTGCATGA3’或5’CAACGCGCAAAACCTTACCA3’5’AACGATGAGTGTTCGCCCTT3’P2：5’AACGATGAGTGTTCGCCCTT3’5’GGCAATCTTTCCGGATTCGC3’或5’AGCACTACCGGTGGAAGGTA3’5’TTAGCCAAAGGTCGCTTGGA3’。所述提取样本总DNA的方法是将样本液氮处理并碾磨土豆组织，然后使用乙醇沉淀或吸附柱回收，总DNA溶于纯水或PE缓冲液后，50-65℃金属浴或水浴10min，去除残留乙醇得到样本总DNA。所述实时定量PCR反应体系为10或20μL/管，PCR程序为预变性95.0℃2min，变性95.0℃5s，复性延伸60.0℃30s，40次重复，再次变性95.0℃5s，溶解曲线温度范围65℃-95℃，升温速度0.5℃/5s。本专利技术具有以下有益效果：1、专利技术人在研究土豆辐照剂量的评估过程中发现，以特定引物对P1和引物对P2对DNA模板实时定量PCR检测，引物对P2与引物对P1得到的初始循环数的差值与辐照剂量具有相关性，表现为：引物对P2与引物对P1得到的初始循环数的差值的指数函数值与辐照剂量呈线性关系，辐照剂量越大，P1与P2检测样本得到初始循环数差值的指数函数值越小。本专利技术首次将这种相关性作为辐照定量鉴定的鉴定特征，通过将经过已知辐照剂量的样本分别采用特定引物P1-P2实时定量PCR检测，并构建出“辐照剂量——初始循环数差值的指数函数值”标准曲线，当检测待检土豆辐照剂量时，只需将特定引物P2实时定量PCR得到的初始循环数与引物P1实时定量PCR得到的初始循环数差值的指数函数值代入“辐照剂量——初始循环数差值的指数函数值”标准曲线，即可推导得到待检土豆样本的辐照剂量，为土豆辐照剂量的定量检测提供有效可靠的检测手段。2、本专利技术中提出使用DNA模板间的倍数关系进行定量鉴定。基于完整细胞内的DNA模板间倍数关系在固定物种内可维持固定比例的原理，在定量PCR中，总DNA模板扩增目标序列间相对倍数呈现为不同引物的初始循环数差值以2为底数的指数函数值，采用这种方法可抵消参比样本DNA模板间由于核酸含量不均一导致的结果偏差，降低因采样条件和操作差异导致结果偏差的可能性；3、本专利技术使用DNA损伤量化评估体系对样本进行鉴定，使用线性方程推导辐照剂量，结果的重现性和准确性均高于原有基于图像观测判定的鉴定方法；4、本专利技术鉴定方法的实现条件主要为DNA提取试剂、定量P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过PCR技术评估土豆辐照剂量的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：A、构建“辐照剂量——初始循环数差值的指数函数值”标准曲线取同批未辐照土豆若干，按一定梯度剂量进行辐照处理，并记录辐照剂量，提取各样本的总DNA，提取得到的总DNA模板采用引物对组合P1‑P2进行实时定量PCR检测，通过Livak分析,得到各样本的初始循环数差值；以辐照剂量值作为纵轴；计算引物对P2与引物对P1实时定量PCR检测得到的始循环数差值为指数以2为底数的指数函数值，将其作为横轴进行线性回归，构建“辐照剂量——初始循环数差值的指数函数值”标准曲线；B、初始循环数差值的指数函数值提取待检土豆样本总DNA，按照步骤A进行实时定量PCR检测，通过Livak分析，分别得到待检土豆样本引物对P2和P1的初始循环数值并计算得到引物对P2与P1的初始循环数的差值，从而得到初始循环数的差值的指数函数值；C、将步骤B得到的初始循环数差值的指数函数值带入步骤A的标准曲线，推导得到对应的辐照剂量并计算其平均值即得待检土豆样本的辐照剂量；其中，所述引物对组合P1‑P2序列为：P1：5’AACGATGAGTGTTCGCCCTT 3’5’GGCAATCTTTCCGGATTCGC 3’或5’CAACGCGCAAAACCTTACCA3’5’AACGATGAGTGTTCGCCCTT 3’P2：5’ATTCGGCCTAGCTCTGTGAC 3’5’TGAGATGCCCAACTGCATGA3’或5’AGCACTACCGGTGGAAGGTA3’5’TTAGCCAAAGGTCGCTTGGA 3’。...

【技术特征摘要】
1.一种通过PCR技术评估土豆辐照剂量的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：A、构建“辐照剂量——初始循环数差值的指数函数值”标准曲线取同批未辐照土豆若干，按一定梯度剂量进行辐照处理，并记录辐照剂量，提取各样本的总DNA，提取得到的总DNA模板采用引物对组合P1-P2进行实时定量PCR检测，通过Livak分析,得到各样本的初始循环数差值；以辐照剂量值作为纵轴；计算引物对P2与引物对P1实时定量PCR检测得到的始循环数差值为指数以2为底数的指数函数值，将其作为横轴进行线性回归，构建“辐照剂量——初始循环数差值的指数函数值”标准曲线；B、初始循环数差值的指数函数值提取待检土豆样本总DNA，按照步骤A进行实时定量PCR检测，通过Livak分析，分别得到待检土豆样本引物对P2和P1的初始循环数值并计算得到引物对P2与P1的初始循环数的差值，从而得到初始循环数的差值的指数函数值；C、将步骤B得到的初始循环数差值的指数函数值带入步骤A的标准曲线，推导得到对应的辐照剂量并计算其平均值即得待检土豆样本的辐照剂量；其中，所述引物对组合P1-P2序列为：P1：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘绵学，黄敏，伏毅，王艳，瞿攀，
申请(专利权)人：四川省原子能研究院，
类型：发明
国别省市：四川,51