检测II型草鱼呼肠孤病毒疫苗中病毒含量的试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种检测II型草鱼呼肠孤病毒疫苗中病毒含量的试剂盒及方法，进一步地涉及活疫苗或灭活疫苗(病毒灭活前)的病毒含量的测定，所述试剂盒包括用于检测基因II型GCRV VP41的血清抗体、FITC标记的羊抗兔IgG、阳性对照样品、固定液和PBS洗液。检测方法为将活疫苗或灭活疫苗(病毒灭活前)进行梯度稀释后接种于PSF细胞，连续培养完成后再用本发明专利技术所述的试剂盒进行免疫荧光检测，将检测结果进行计算得出相应的病毒含量。本发明专利技术的试剂盒及方法灵敏度高、特异性强，且能定量检测活病毒。

Kit and method for detecting virus content in II type grass carp reovirus vaccine

The present invention relates to a kit and method for detecting the virus content in the II type grass carp reovirus vaccine, and further relates to the determination of the virus content of the live vaccine or inactivated vaccine (before the virus inactivated). The kit includes the serum anti body of the gene II type GCRV VP41, the FITC labeled Sheep anti rabbit IgG, the positive pair Products, fixed liquid and PBS lotion. The detection method was to inoculate the live vaccine or inactivated vaccine (before the inactivation of the virus) to the PSF cells. After continuous culture, the immunofluorescence detection was carried out with the reagent box described in this invention. The results were calculated and the corresponding virus content was calculated. The kit and method of the invention have high sensitivity and specificity, and can quantitatively detect live viruses.

【技术实现步骤摘要】
检测II型草鱼呼肠孤病毒疫苗中病毒含量的试剂盒及方法
本专利技术属于水生动物病毒检测
，具体涉及一种检测II型草鱼呼肠孤病毒疫苗中病毒含量的试剂盒及方法，进一步地涉及基因II型草鱼呼肠孤病毒活疫苗或灭活疫苗(病毒灭活前)中病毒含量的测定方法。
技术介绍
草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是中国淡水养殖的主要品种之一，除西藏、青海零星养殖外，在我国各地均有一定规模养殖。2017年全国渔业统计年鉴显示，我国淡水鱼类养殖产量为2815.54万吨，其中草鱼的养殖产量达589.88万吨，为我国所有养殖鱼类之首。草鱼养殖为保障我国农产品市场供给和人民生活水平的提高做出了重要贡献。然而草鱼也是水产养殖动物中病害最为多发的一种鱼类，主要病害包括草鱼出血病、肠炎病、赤皮病、烂鳃病、车轮虫等，全年最高发病率在8月，据不完全统计由疾病造成的经济损失约5亿元。在感染草鱼的所有病原中，草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovims，GCRV)，俗称草鱼出血病病毒(GCHV)，感染导致的草鱼出血病危害最大，成为我国淡水水产养殖中最为突出的问题之一。草鱼呼肠孤病毒(GCRV)，隶属于水生呼肠孤病毒属，是水生呼肠孤病毒属中危害最大的病原之一，也是中国分离的第一株水生动物病毒，其发现可以追溯到1953年，因为草鱼发病的症状有“红肌肉型”、“肠炎型”、“红鳍红鳃盖型”，所以称此病为草鱼出血病。1995年，病毒分类命名委员会对该病毒正式命名为草鱼呼肠孤病毒(GrassCarpReovirus,GCRV)。由GCRV引起的出血病严重危害当年草鱼鱼种，流行范围广，发病季节长，发病率高，死亡率可高达90％以上，给水产养殖业造成巨大损失。该病害自上世纪50年代发现以来，相继在湖北、湖南、广东、广西、江苏、浙江、安徽、福建、上海、四川等省、市、自治区主养区流行。目前草鱼出血病有加重蔓延趋势，发病以后极难控制。到目前为止草鱼出血病还没有特效药物治疗，免疫预防是控制草鱼出血病最有效的防治方法。从上世纪土法疫苗到细胞灭活疫苗，再到现在的弱毒疫苗，草鱼出血病疫苗是水产动物中研发得最成功、应用得最广泛的疫苗产品。从已有的流行病学调查数据来看，GCRV的流行情况复杂，目前已经分离的毒株超过40余株，在感染细胞和宿主致病性方面存在较大差异，对已有毒株的全基因和部分基因组进行分析后发现，GCRV至少存在三个基因型，分别有三个代表株GCRVJX0901(I型)、HZ08(II型)和104(III型)，目前以基因II型为主要流行株。不同基因型GCRV的生物学特性比较显示，属于基因I型的GCRVJX0901可以感染多种细胞并产生典型的细胞融合性病变，而属于基因II型的HZ08株感染现有的各种鱼类细胞都未能观察到明显的致细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)。Nibert和Duncan通过基因组分析比较，发现归为Aqua-C亚型的GCRV标准株(基因I型)基因组有FAST(Fusionassociatedsmalltransmembraneprotein)蛋白编码基因，而基因II型HZ08株缺乏编码FAST蛋白的基因，因此不能在细胞上产生病变效应。目前基因II型GCRV已经成为草鱼出血病的主要流行基因型，该病毒可以感染多种草鱼细胞，但是无法形成细胞病变，因此病毒定量检测主要依赖分子生物学方法。分子生物学方法检测灵敏度高，操作简便，但不能区分感染性和非感染性的病毒，因此到目前为止，对基因II型草鱼出血病活疫苗和灭活疫苗(病毒灭活前)中病毒含量测定还没有一种稳定性、重复性好的定量方法，还不能进行感染性病毒含量测定。因此，有必要提供一种操作更方便，检测更精确的可进行GCRV感染性病毒含量测定的方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种检测II型草鱼呼肠孤病毒疫苗中病毒含量的试剂盒及方法，进一步地涉及活疫苗或灭活疫苗(病毒灭活前)的病毒含量的测定，检测的方法灵敏度高、特异性强，且能定量检测活病毒。为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一方面，本专利技术提供一种检测II型草鱼呼肠孤病毒疫苗中病毒含量的试剂盒，包括用于检测基因II型GCRVVP41的血清抗体、FITC标记的羊抗兔IgG、阳性对照样品、固定液和PBS洗液。进一步地，所述用于检测基因II型GCRVVP41的血清抗体的工作浓度为1:100倍稀释。进一步地，所述用于检测基因II型GCRVVP41的血清抗体的制备过程如下：将GCRVVP41的基因克隆到pET-32a(+)表达载体中，再将表达载体转化到大肠杆菌表达菌进行诱导表达；纯化表达产物后免疫兔，取兔血收集血清，制备出用于检测基因II型GCRVVP41的血清抗体。更进一步地，所述GCRVVP41的基因克隆到pET-32a(+)表达载体的过程如下：用GCRVHZ08感染PSF细胞后提取RNA，再经反转录获得cDNA；将cDNA进行PCR扩增回收后与pET-32a(+)表达载体连接得到连接产物。更进一步地，所述诱导表达过程如下：将连接产物转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆后转化至大肠杆菌表达菌进行诱导表达。更进一步地，所述取兔血收集血清的具体过程如下：取兔血静置后离心得到血清，用亲和纯化的方式进行纯化即可。进一步地，所述FITC标记的羊抗兔IgG的工作浓度为1:500倍稀释。进一步地，所述阳性对照样品为GCRVHZ08株。进一步地，所述固定液为丙酮与甲醇体积比3:2配置的固定液。进一步地，所述PBS洗液为磷酸盐缓冲液：按NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO4·12H2O3.58g；KH2PO40.24g定容至1L制备，调pH至7.2。进一步地，所述试剂盒还包括封闭液1％BSA/PBS溶液。另一方面，本专利技术提供一种运用本专利技术所述的检测II型草鱼呼肠孤病毒疫苗中病毒含量的试剂盒对活疫苗中病毒含量进行检测的方法，包括如下步骤：将活疫苗进行梯度稀释后接种于PSF细胞，连续培养完成后再用本专利技术所述的检测试剂盒进行免疫荧光检测，将检测结果进行计算得出相应的病毒含量。进一步地，所述计算采用Karber法进行。优选地，所述Karber法的计算公式为：lgTCID50＝L-D×(S-0.5)其中，L:最高稀释倍数的对数；D:稀释度对数之间的差；S:阳性孔比率总和。进一步地，所述PSF细胞为长成85％的单层PSF细胞。进一步地，所述连续培养的天数为7天。进一步地，所述梯度稀释是指进行连续10倍梯度稀释，共稀释6个梯度，梯度范围为10-1～10-6。另一方面，本专利技术提供一种运用本专利技术所述的检测II型草鱼呼肠孤病毒疫苗中病毒含量的试剂盒对灭活疫苗中病毒灭活前的病毒含量进行检测的方法，包括如下步骤：将病毒灭活前的灭活疫苗进行梯度稀释后接种于PSF细胞，连续培养完成后再用本专利技术所述的检测试剂盒进行免疫荧光检测，将检测结果进行计算得出相应的病毒含量。进一步地，所述计算采用的Karber法进行。优选地，所述Karber法的计算公式为：lgTCID50＝L-D×(S-0.5)其中，L:最高稀释倍数的对数；D:稀释度对数之间的差；S:阳性孔比率总和。进一步地，所述PSF细胞为长成85％的单层PSF细胞。进一步地，所述连续培养的天数为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测II型草鱼呼肠孤病毒疫苗中病毒含量的试剂盒，其特征在于，包括用于检测基因II型GCRV VP41的血清抗体、FITC标记的羊抗兔IgG、阳性对照样品、固定液和PBS洗液。

【技术特征摘要】
1.一种检测II型草鱼呼肠孤病毒疫苗中病毒含量的试剂盒，其特征在于，包括用于检测基因II型GCRVVP41的血清抗体、FITC标记的羊抗兔IgG、阳性对照样品、固定液和PBS洗液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测基因II型GCRVVP41的血清抗体的工作浓度为1:100倍稀释。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测基因II型GCRVVP41的血清抗体的制备过程如下：将GCRVVP41的基因克隆到pET-32a(+)表达载体中，再将表达载体转化到大肠杆菌表达菌进行诱导表达；纯化表达产物后免疫兔，取兔血收集血清，制备出用于检测基因II型GCRVVP41的血清抗体。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述FITC标记的羊抗兔IgG的工作浓度为1:500倍稀释。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照样品为GCRVHZ08株；所述固定液为丙酮与甲醇体积比3:2配置的固定液；所述PBS洗液为磷酸盐缓冲液：按NaCl8.0g；KCl0.2g；Na...

【专利技术属性】
技术研发人员：王庆，曾伟伟，王英英，常藕琴，刘春，李莹莹，尹纪元，任燕，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44