一种胰蛋白酶活性检测的方法技术

本发明专利技术属于生物领域，具体地涉及一种胰蛋白酶活性检测的方法。本发明专利技术多肽在胰蛋白酶酶切前后与负载电化学活性分子硫堇的氧化石墨烯间相互作用的差异构建了一种简便的检测胰蛋白酶活性的方法，氧化石墨烯具有较大的比表面积，可以负载大量的硫堇，起到电化学信号放大的，提高检测的灵敏度；本发明专利技术通过底物多肽通过末端半胱氨酸的巯基与金形成金巯键共价修饰到金电极表面，带有巯基的多肽共价修饰至金表面，然后用巯基己醇占位，去除非特异性吸附的多肽，封闭电极表面空白位置，底物多肽序列N末端组氨酸，组氨酸带正电荷，富含羧基的氧化石墨烯解离后带负电荷，两者之存在较强的静电相互作，从而使所制备得到的复合物吸附至最终修饰电极产物。

A method for the detection of trypsin activity

The invention belongs to the biological field, and specifically relates to a method for detecting trypsin activity. A simple method for the detection of trypsin activity between trypsin and the interaction between trypsinase and electrochemically active molecule thio oxide has been constructed. It has a large specific surface area and can load a large amount of thio, amplifying the electrochemical signal and improving the detection. The sensitivity of the test is modified to the gold electrode surface through the sulfhydryl thiol group of the terminal cysteine and gold thiol bonds of the terminal cysteine, which is covalently modified to the gold surface with mercapto polypeptides, and then uses mercapto hexanol to occupy the position to remove non specific adsorbed polypeptides, close the blank position of the electrode surface, and the sequence of the substrate polypeptide N The terminal histidine, the histidine with positive charge, the carboxyl rich graphene oxide and the negative charge after the dissociation, have strong electrostatic interaction between them, so that the prepared complexes are adsorbed to the final modified electrode products.

【技术实现步骤摘要】
一种胰蛋白酶活性检测的方法
本专利技术属于生物领域，具体地涉及一种胰蛋白酶活性检测的方法。
技术介绍
胰蛋白酶是一种应用广泛的蛋白水解酶，通过识别精氨酸或者赖氨酸等侧链上的正电荷，特异性水解其羧基端的肽键，是一种肽链内切酶。根据带点性质的不同可分为阳离子型胰蛋白酶，阴离子型胰蛋白酶，中性胰蛋白酶。胰蛋白酶主要用于糜蛋白酶原，羧肽酶原等的激活。胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。传统的检测胰蛋白酶含量的方法为分光光度法，然而，分光光度法检测胰蛋白酶的步骤较多，不但操作繁琐，而且检测灵敏度较低，因此需要发展一种简单的、灵敏度高的检测胰蛋白酶含量的方法。目前发展起来的测定胰蛋白酶的方法主要有紫外分光光度法、比色法、荧光法、免疫法、放射性元素标记法、质谱法（MS）、液相色谱法（HPLC）、电泳法等。紫外法和比色法操作简单，但灵敏度低，重现性差。免疫法灵敏度高，但由于单克隆抗体的使用使得成本也高，且需要一定的操作技术。放射性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰蛋白酶活性检测的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）将氧化石墨烯超声后加入硫堇混合均匀，搅拌，再加入超纯水混合，过滤，取滤渣，干燥，得复合物，备用；（2）取质量分数为80%的硫酸溶液与质量分数为30%的双氧水混合均匀，得金电极浸泡液，取金电极置于金电极浸泡液中浸泡，取出用蒸馏水冲洗，用0.3μm的氧化铝粉末打磨，取打磨后金电极依次浸入质量分数为80%的乙醇溶液和超纯水中各超声5~10min，得超声后金电极，取超声后金电极置于浓度为0.5mol/L的硫酸溶液中搅拌混合，得活化金电极；（3）取底物多肽加入HEPES缓冲液中搅拌溶解，得多肽溶液，取活化金电极浸入多肽溶液，于20~30℃...

【技术特征摘要】
1.一种胰蛋白酶活性检测的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）将氧化石墨烯超声后加入硫堇混合均匀，搅拌，再加入超纯水混合，过滤，取滤渣，干燥，得复合物，备用；（2）取质量分数为80%的硫酸溶液与质量分数为30%的双氧水混合均匀，得金电极浸泡液，取金电极置于金电极浸泡液中浸泡，取出用蒸馏水冲洗，用0.3μm的氧化铝粉末打磨，取打磨后金电极依次浸入质量分数为80%的乙醇溶液和超纯水中各超声5~10min，得超声后金电极，取超声后金电极置于浓度为0.5mol/L的硫酸溶液中搅拌混合，得活化金电极；（3）取底物多肽加入HEPES缓冲液中搅拌溶解，得多肽溶液，取活化金电极浸入多肽溶液，于20~30℃放置16~18h，取出修饰后电极，用清洗缓冲液冲洗，再加入6-巯基己-1-醇和蒸馏水混合，浸泡，得自组装电极，用清洗缓冲液冲洗，取自组装电极浸泡于清洗缓冲液中，得最终修饰电极产物；（4）取胰蛋白酶与磷酸盐缓冲液和最终修饰电极产物混合，反应，得反应物，取步骤（1）备用的复合物加入反应物和超纯水，继续反应，用清洗缓冲液冲洗，将冲洗后反应物置于电化学工作站进行胰蛋白酶的检测，即可检测胰蛋白酶。2.根据权利要求1所述的胰蛋白酶活性检测的方法，其特征在于，所述步骤（1）中超声条件为：-2~-4℃条件下超声30~40min，超声后氧化石墨烯按质量比5：3加入硫堇；再加入超声后石墨烯质量60~70%加入超纯水。3.根据权利要求1所述的胰蛋白酶活性检测的方法，其特征在于，所述步骤（2）底物多肽具体序列为HHHKSAGTGC。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴昌财，郑薇，林凡，
申请(专利权)人：常州市阿曼特化工有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32