用于多重PCR文库构建的连接序列及其设计方法技术

本发明专利技术公开了用于多重PCR文库构建的连接序列及其设计方法。基于本发明专利技术的连接序列能通过PCR扩增实现标签、测序接头、目标片段的连接，其设计方法包括：获取候选序列集、候选序列初筛、e‑PCR分析；本发明专利技术的连接序列排除了与扩增体系中其他序列的相互干扰，构建的文库质量好，并且通用性强，不仅适于一步和两步扩增建库，还适于多种核酸测序文库的构建，如检测遗传性耳聋致病位点、苯丙酮尿症致病基因、肺癌靶向用药基因、乳腺癌BRCA1/2突变基因、安全用药基因的测序文库，基于连接序列的文库构建简化了建库流程，大大节约测序成本，还可应用于核酸测序试剂盒中，具有非常良好的市场应用前景。

Connection sequences used for constructing multiple PCR libraries and their design methods

The invention discloses a connection sequence used for constructing multiple PCR libraries and a design method thereof. The connection sequence based on this invention can connect the label, the sequencing joint and the target fragment through the PCR amplification. The design method includes: obtaining the candidate sequence set, the candidate sequence screening, and the e PCR analysis; the connection sequence of the invention excludes the interference from the other sequences in the amplification system, and the quality of the constructed library is good, and And it is versatile, not only suitable for one step and two steps to build up the library, but also suitable for the construction of a variety of nucleic acid sequencing libraries, such as detection of hereditary deafness site, phenylketonuria, lung cancer target gene, BRCA1/2 mutant gene of breast cancer, and the sequence library based on the connection sequence. It simplifies the process of building library, greatly reduces the cost of sequencing, and can be applied to nucleic acid sequencing kit. It has a very good market prospect.

【技术实现步骤摘要】
用于多重PCR文库构建的连接序列及其设计方法
本专利技术属于高通量测序领域，更具体地涉及用于多重PCR文库构建的连接序列及其设计方法。
技术介绍
核酸测序已经成为生物学研究、疾病筛查、医学辅助诊断中不可缺少的一项重要技术，从根本上改变了人类研究生命蓝图的方式。高通量测序是目前主流的核酸测序方法，其具有费用低、通量大、速度快的优势。现有的高通量测序平台主要包括Illumina公司的Solexa测序平台、Roche公司的454平台、Life公司的Iontorrent平台。随着测序平台硬件及软件的提升，阻碍高通量测序技术发展的却是文库构建以及后续的数据分析。其中，所有测序平台都涉及复杂的文库构建过程，一方面需要捕获目标片段，另一方面还需要将平台配套的测序接头和区分样本的标签连接到捕获片段上。以基于多重PCR捕获的文库构建过程为例，基础方法包括如下步骤：(1)多重PCR捕获目的片段；(2)引物和/或修饰清除；(3)测序接头和/或标签连接；(4)磁珠纯化；(5)PCR扩增富集。在此基础流程上做出的改进主要有：(1)测序接头和标签的连接与PCR扩增合并为一步；(2)多重PCR捕获目标片段与测序接头和/或标签连接合并为一步；(3)无引物和/或修饰清除步骤，(4)以上情况的组合等等，其主要目的都是简化流程，节约成本。文库构建过程的简化并非易事，每个步骤的改进或去除都会影响文库构建的质量，如文库浓度，文库片段分布，进而影响扩增子均一性、数据利用率等。此外，更不容忽视的是，PCR测序文库构建过程中，涉及的反应序列复杂多样，如特异性引物序列、测序接头序列、多个标签序列等等，如何在建库步骤中排除或降低序列之间的相互干扰，获得良好的文库质量，并且兼顾序列的通用性，是需要设计者有创造性地去设计和改进才能实现的。
技术实现思路
基于
技术介绍
谈及的技术问题，本专利技术的目的在于提供一种用于多重PCR文库构建的连接序列及其设计方法；还提供以上连接序列和基于连接序列构成的连接引物、连接接头、连接标签在核酸测序文库构建和制备核酸测序试剂盒中的应用。本专利技术所采取的技术方案是：一种用于多重PCR文库构建的连接序列，所述连接序列设置于目标片段特异性引物的5’端，构成连接引物；所述连接序列还设置于测序接头的3’端，构成连接接头；基于连接序列的设置，通过PCR扩增实现目标片段与测序接头的连接。作为上述连接序列的改进，所述连接序列还可设置于标签的3’端，构成连接标签，通过PCR扩增实现标签、测序接头、目标片段的连接。作为上述连接序列的优选，所述连接序列选自SEQIDNO:1～SEQIDNO:7任意一条核苷酸序列。作为上述连接序列的优选，所述连接序列用于Iontorrent测序平台。作为上述连接序列的优选，所述连接序列适用于人核酸测序文库构建。如上所述的连接序列的设计方法，包括如下步骤：获取候选序列集：采用滑窗法构建人类远源物种基因组核苷酸序列集N和人类基因组核苷酸序列集M，将序列集M中出现的序列从序列集N中剔除，获得候选序列集；候选序列初筛：在候选序列集中，筛选满足以下条件的序列：(1)解链温度为55～65℃的序列；(2)不包含未知碱基的序列；(3)与序列自身、测序接头不形成二聚体的序列；e-PCR复筛：将初筛获得的序列对人类参考基因组进行e-PCR分析，筛选不生成模拟扩增产物的序列作为连接序列。作为上述设计方法的优选，获取候选序列集时，滑窗法以15～20bp为窗口大小，1bp为步长，扫描相应的参考基因组。作为上述设计方法的优选，筛选与序列自身、测序接头不形成二聚体的序列的方法为：利用primer软件，将候选序列集中的各条序列分别与序列自身、测序接头进行二聚体分析，剔除能够形成二聚体的序列。作为上述设计方法的优选，所述人类远源物种包括细菌、真菌、植物、人类远源动物；所述人类远源物种至少选择一个物种。如上所述的连接序列、连接引物、连接接头、连接标签在核酸测序文库构建及制备核酸测序试剂盒中的应用。本专利技术的有益效果是：基于本专利技术的连接序列，能通过PCR扩增实现标签、测序接头、目标片段的连接，其设计方法包括：获取候选序列集、候选序列初筛、e-PCR复筛；本专利技术的连接序列与扩增体系中其他序列的相互干扰小，构建的文库质量好，并且通用性强，不仅适于一步和两步扩增建库，还适于多种核酸测序文库的构建，如检测遗传性耳聋致病位点、苯丙酮尿症致病基因、肺癌靶向用药基因、乳腺癌BRCA1/2突变基因、安全用药基因的核酸测序文库，基于连接序列的核酸测序文库构建简化了建库流程，大大节约了测序成本，还可应用于核酸测序试剂盒中，具有非常良好的市场应用前景。此外，专利技术人基于连接序列的作用，创造性的提出了一套连接序列的设计方法，综合考虑了序列长度、解链温度、序列间相互作用、与人类基因组互斥等方面的因素，通过该设计方法，可以筛选出特异性高，通用性强的连接序列，实现连接序列在核酸测序文库构建及核酸测序试剂盒中的应用。附图说明图1是不同连接序列构建的遗传性耳聋致病位点文库的片段分布，其中，图A～G基于连接序列U1～U7；图2是连接序列U4构建的遗传性耳聋致病位点文库的扩增子均一性箱式图，其中横坐标为扩增子，纵坐标为reads数；图3是实施例3构建的苯丙酮尿症突变基因文库的测序峰图；图4是实施例3构建的苯丙酮尿症突变基因文库的扩增子均一性箱式图，其中横坐标为扩增子，纵坐标为reads数；图5是实施例4构建的肺癌靶向用药基因文库的测序峰图；图6是实施例4构建的肺癌靶向用药基因文库的扩增子均一性箱式图，其中横坐标为扩增子，纵坐标为reads数；图7是实施例5构建的乳腺癌BRCA1/2突变基因文库的测序峰图；图8是实施例5构建的乳腺癌BRCA1/2突变基因文库的扩增子均一性箱式图，其中横坐标为扩增子，纵坐标为reads数；图9是实施例6构建的安全用药基因文库的测序峰图；图10是实施例6构建的安全用药基因文库的扩增子均一性箱式图，其中横坐标为扩增子，纵坐标为reads数。具体实施方式一种用于多重PCR文库构建的连接序列，所述连接序列设置于目标片段特异性引物的5’端，构成连接引物；所述连接序列还设置于测序接头的3’端，构成连接接头；基于连接序列的设置，通过PCR扩增实现目标片段与测序接头的连接；更进一步的，所述连接序列还可设置于标签的3’端，构成连接标签，通过PCR扩增实现标签、测序接头、目标片段的连接；所述扩增可选一步或两步扩增，但不限于此。作为优选的，所述连接序列选自SEQIDNO:1～SEQIDNO:7任意一条核苷酸序列。进一步优选的，所述连接序列用于Iontorrent测序平台。进一步优选的，所述连接序列适用于人核酸测序文库构建。其中，目标片段特异性引物、测序接头和标签属于本领域的公知常识，目标片段特异性引物可根据本领域公知技术设计获得，如oligo引物设计软件；测序接头是依据测序平台的适应性选择，如实施例中利用Iontorrent测序平台的A接头和P接头，标签可利用本领域公知的常规标签，如Life平台提供的96标签(Barcode01～Barcode96)。基于本专利技术的“连接序列”，可将文库构建流程简化，经过一步或两步PCR扩增，即可获得测序文库。具体地，两步法的建库流程无需清除引物和/或修饰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于多重PCR文库构建的连接序列，所述连接序列设置于目标片段特异性引物的5’端，构成连接引物；所述连接序列还设置于测序接头的3’端，构成连接接头；基于连接序列的设置，通过PCR扩增实现目标片段与测序接头的连接。

【技术特征摘要】
1.一种用于多重PCR文库构建的连接序列，所述连接序列设置于目标片段特异性引物的5’端，构成连接引物；所述连接序列还设置于测序接头的3’端，构成连接接头；基于连接序列的设置，通过PCR扩增实现目标片段与测序接头的连接。2.根据权利要求1所述的用于多重PCR文库构建的连接序列，其特征在于：所述连接序列还可设置于标签的3’端，构成连接标签，通过PCR扩增实现标签、测序接头、目标片段的连接。3.根据权利要求1或2所述的用于多重PCR文库构建的连接序列，其特征在于：所述连接序列选自SEQIDNO:1～SEQIDNO:7任意一条核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的用于多重PCR文库构建的连接序列，其特征在于：所述连接序列用于Iontorrent测序平台。5.根据权利要求3所述的用于多重PCR文库构建的连接序列，其特征在于：所述连接序列适用于人核酸测序文库构建。6.如权利要求1～5任一项所述的连接序列的设计方法，包括如下步骤：获取候选序列集：采用滑窗法构建人类远源物种基因组核苷酸序列集N和人类基因组核苷酸序列集M，将序列集M中出...

【专利技术属性】
技术研发人员：糜庆丰，朱鹏远，吴春求，黄铨飞，王杨，周幸芝，吕来灰，
申请(专利权)人：东莞博奥木华基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44