北美猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了包含对感染性RNA序列进行编码的DNA序列的分离多核苷酸分子，所述感染性RNA序列编码经遗传修饰的北美PRRS病毒，还提供了制备所述多核苷酸分子和相关的多肽、多核苷酸和各种组分的方法。此外，还提供了包含所述遗传修饰的病毒和多核苷酸的疫苗以及区分天然受感染动物和经疫苗接种的动物的诊断试剂盒。

North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRS) and its application

The present invention provides a separate polynucleotide molecule containing a DNA sequence encoding an infectious RNA sequence. The infectious RNA sequence encodes a genetically modified North American PRRS virus, and also provides a method for preparing the polynucleotide molecule and related peptides, polynucleotides and various components. In addition, a vaccine containing the genetic modification of the virus and polynucleotide as well as a diagnostic kit to distinguish between naturally infected animals and vaccinated animals is also provided.

【技术实现步骤摘要】
北美猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒及其应用本申请是申请日为2011年11月9日、申请号为201180064674.2、专利技术名称为“北美猪繁殖与呼吸综合征(PPRS)病毒及其应用”的专利申请的分案申请。
本专利技术属于动物健康领域，并针对正极性RNA病毒、新型RNA病毒及其经修饰的活性形式的感染性cDNA克隆体，以及使用此类cDNA克隆体的疫苗(具体为猪疫苗)的构建。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的特征在于母猪与初产母猪中的流产、死产和其他繁殖问题以及幼猪的呼吸道疾病。病原体是PRRS病毒(PRRSV)，该病毒是套式病毒目动脉炎病毒科的成员。套式病毒是具有由正极性RNA的单链组成的基因组的具包膜病毒。正链RNA病毒的基因组RNA满足储存和表达遗传信息的双重作用。在套式病毒的复制和转录中不涉及DNA。非结构性蛋白作为大的多聚蛋白从套式病毒的基因组RNA被直接翻译并随后由病毒蛋白酶切割为不同的功能蛋白。从所述基因组合成了3’同末端成套的亚基因组RNA(sgRNA)，且其用作用于结构蛋白的翻译的信使RNA。因此，套式病毒基因组RNA的繁殖是基因组复制和sgRNA合成的组合过程。二十世纪八十年代晚期，该病毒的两种不同基因型几乎同时出现，一种在北美，另一种在欧洲。PRRS病毒现在几乎在所有产猪的国家流行，并被认为是在经济上最重要的影响全球猪肉工业的疾病之一。另外，在中国和周边国家已经分离出了高毒性的基因型，且这些基因型通常与北美基因型相关。虽然对PRRSV的生物学的理解取得了重大进展，然而对该病毒的控制仍然很难。对农场的动物进行疫苗接种已被证实非常没有效果。PRRS通常在经免疫的畜群中重新出现，并且大多数在农场的PRRSV疫苗接种活动最终都未能控制该疾病。不受理论限制，猪受野生型PRRSV的感染或者用该病原体的活减毒形式对猪进行的疫苗接种遗憾地仅会引发非中和性抗体的大量产生。在此时期内，例如，仅产生有限量的分泌干扰素(IFN)-γ的细胞。因此，PRRSV似乎固有地刺激不平衡的由一贯充足的体液(基于抗体的)免疫所辨别的免疫应答，以及可变且有限但具有潜在保护性的T辅助(Th)1样IFN-γ应答。PRRSV感染的最可能促成适应性免疫的不平衡发展的一个特征在于缺乏适当的天然免疫应答。通常，受病毒感染的细胞分泌I型干扰素“IFN”(包括IFN-α和IFN-β)，其保护邻近细胞不受感染。另外，所释放的I型IFN与幼稚T细胞亚组相互作用以促进其向分泌病毒特异性II型IFN(IFN-γ)的细胞转化。相比之下，猪对于PRRSV接触的IFN-α应答近乎不存在。据预期，这种病原体对IFN-α生成的无效率的刺激会对宿主的适应性免疫应答的性质产生显著影响，因为IFN-α会上调IFN-γ基因表达。因此，前一细胞因子控制促进适应性免疫的发展的主导途径，即T细胞介导的IFN-γ应答和峰期抗病毒免疫防御。就此而言，已逐渐明晰的是，病毒感染的天然免疫和适应性免疫之间通过特定类型的树突细胞而出现可能的联系，所述树突细胞能够产生大量的I型干扰素且在T细胞功能的极化中起到关键性作用。具体地，一种出现不太频繁但重要的树突细胞(浆细胞样树突细胞(PDC))，也称作天然IFN-α/β生成细胞)借助其导致幼稚T细胞分化为IFN-γ分泌细胞的能力而在抗病毒免疫中起着重大作用。虽然罕见，但PDC是极为强力的IFN-α生成者，每个细胞能够响应于病毒而产生3pg至10pg的IFN-α。相比之下，在单个细胞的基础上，单核细胞产生低5倍至10倍的IFN-α。此前对猪PDC的表型和某些生物学性质已经有所描述(Summerfield等，2003,Immunology110:440)。近期研究已经确定，PRRSV不会刺激猪PDC分泌IFN-α(Calzada等，2010,VeterinaryImmunologyandImmunopathology135:20)。这一事实结合下述观察结果强调了IFN-α在猪受PRRSV病毒感染期间起到的关键性作用，所述观察结果表明，据发现在疫苗接种时从外部添加的IFN-α会改善PRRSV特异性IFN-γ应答的强度(W.A.Meier等，Vet.Immunol.Immunopath.102,第299-314页,2004)。既然IFN-α对保护性免疫的发展具有显然的重大作用，重要的是确定不同的PRRS病毒储液刺激和/或抑制IFN-α产生的能力。因此，存在对于针对PRRS进行保护的新型和改良的经修饰的活疫苗的迫切需要。如下文所述，显而易见的是，源自新型感染性cDNA克隆体pCMV-S-P129-PK等的病毒具有与野生型P129病毒或两种可商购的经修饰的活PRRS疫苗不同的表型。不受限于理论，本专利技术提供了可促进基于细胞的针对所述病毒的免疫应答的疫苗，并且限定了新一代的有效PRRS疫苗。
技术实现思路
在第一实施方式中，本专利技术提供了一种分离的多核苷酸分子，其包括对编码北美PRRS病毒的感染性RNA分子进行编码的DNA序列，所述PRRS病毒经过遗传修饰从而其作为疫苗可引发猪类动物中针对该PRRS病毒的有效免疫保护性应答。在某些方面，本专利技术提供了如本文所描述的包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的DNA序列，或具有与该DNA序列的至少70％同一性、优选与之80％的同一性、且更优选与之85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的序列。在某些实施方式中，本专利技术提供了一种质粒，该质粒包含本文所述的分离的多核苷酸分子和能够在合适的宿主细胞中转录所述多核苷酸分子的启动子。在另一个实施方式中，本文的质粒的北美或中国PRRS编码序列还对一种以上的可检测的异源性抗原表位进行编码。本专利技术提供了包括本文所述的质粒的经转染的宿主细胞。在另一方面，本专利技术提供了用于保护猪类动物不受PRRS病毒感染的疫苗。所述疫苗可以包括由感染性RNA分子编码的北美或中国PRRS病毒，所述感染性RNA分子或质粒各自由本文所述的分离的多核苷酸分子所编码。在再一方面，所述疫苗包含包括本文的多核苷酸的病毒载体。本文所述的疫苗可以可选地包含兽医学应用可接受的疫苗载剂。在一个重要方面，与野生型P129PRRS病毒相比，所述疫苗具有降低的干扰素α抑制效应(参见ATCC203488,203489,美国专利第6,500,662号)。在一个实施方式中，本专利技术提供了一种诊断试剂盒，其包含将受PRRS病毒野生株天然感染的猪类动物与用本文所述的经修饰的活疫苗接种过的猪类动物区分开(所谓DIVA测试)的多核苷酸分子。在其他实施方式中，本专利技术提供了保护猪类动物不受PRRS病毒毒株感染的方法，其包括对动物施用免疫原性保护量的本文所述权利要求的疫苗。本专利技术的其它和优选的实施方式包括：分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)或编码其的多核苷酸序列，其中由ORF1a编码的蛋白选自包含任意以下氨基酸序列的那些蛋白，其中据信下划线的残基为新颖的：AMANVYD(SEQIDNO:9)；IGHNAVM(SEQIDNO:12)；TVPDGNC(SEQIDNO:15)；CWWYLFD(SEQIDNO:18)；HGVHGKY(SEQIDNO:21)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多核苷酸分子，其包括对编码北美PRRS病毒的感染性RNA分子进行编码的DNA序列，其中所述DNA序列是SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
2010.11.10 US 61/412,0061.一种分离的多核苷酸分子，其包括对编码北美PRRS病毒的感染性RNA分子进行编码的DNA序列，其中所述DNA序列是SEQIDNO:1。2.一种宿主细胞，该宿主细胞用权利要求1所述的多核苷酸分子转染。3.一种用于针对PRRS病毒的感染对猪类动物进行保护的疫苗，该疫苗包含以下部分和适合兽医学应用的载剂：(a)由权利要求1所述的多核苷酸分子编码的经遗传修饰的北美PRRS病毒、(b)权利要求1所述的感染性RNA分子、(c)形式为质粒的权利要求1所述的多核苷酸分子或(d)包含权利要求1所述的多核苷酸分子的病毒载体，其中所述PRRS病毒能够引发针对PRRS病毒的感染的有效免疫保护应答，其量能有效产生针对感染的免疫保护。4.如权利要求3所述的疫苗，其中与野生型P129PRRS病...

【专利技术属性】
技术研发人员：SKW维尔奇，JG卡尔弗特，DE斯莱德，
申请(专利权)人：硕腾服务有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US