基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片制造技术

本发明专利技术公开了一种基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，它包括：进样层、反应层和支撑层；进样层包括进样层Ⅰ、防蒸发膜和进样层Ⅱ，所述的进样层中心设有进样口，进样层Ⅱ设有若干进样通道；反应层内设有若干反应室，圆形滤纸片设在反应室内；进样层Ⅰ、进样层Ⅱ和反应层为PDMS材料；以及微流控芯片在病原菌检测方面的应用；本发明专利技术优点在于：将微流控芯片技术与LAMP技术相结合，克服了传统LAMP反应难以进行多目标物同时检测的劣势；利用PDMS材料高气溶性的特质，实现了不借助任何仪器的自动进样，避免了手工进样引起的操作误差，简化了芯片的操作步骤；实现多重病原菌同时检测。

Microfluidic chip for self suction multi-channel pathogen detection based on LAMP

The invention discloses a self suction multichannel pathogen detection microchip based on LAMP, which consists of a sample layer, a reaction layer and a supporting layer. The sample layer includes a sample layer I, an anti steaming film and a sample layer II. The inlet layer center is provided with a sample entrance, and the inlet layer II is provided with a number of sampling channels. In the dry reaction room, the circular filter paper is located in the reaction chamber; the sample layer I, the sample layer II and the reaction layer are PDMS materials, and the application of the microfluidic chip in the detection of pathogenic bacteria. The advantage of the invention is that the microfluidic chip technology is combined with the LAMP technology to overcome the difficulty of simultaneous detection of the multi-objective objects by the traditional LAMP reaction. By using the high gas solubility of PDMS material, the automatic sampling without any instrument is realized, the operation error caused by manual injection is avoided, the operation steps of the chip are simplified, and simultaneous detection of multiple pathogenic bacteria is realized.

【技术实现步骤摘要】
基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片
本专利技术属微生物检测领域，尤其涉及一种基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片及检测方法。
技术介绍
病原菌性疾病时刻威胁着人类的健康。实现高效、准确地病原菌检测是控制该类疾病的关键所在。目前，国内乃至国际上多采用的检测手段是平板培养法或聚合酶链式反应法（PolymeraseChainReaction，PCR），但是由于耗时较长、依赖于仪器等特点，使其难以满足即时检测（Pointofcaretesting）的要求。环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是近年来兴起的核酸等温扩增技术。在无需传统PCR方法的热循环的前提下，LAMP能够实现目标序列的快速指数级扩增。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点；该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。但LAMP尚未尽善尽美。在LAMP反应中，针对每一个目标序列，需要4-6条与之匹配的引物才能完成反应。因而，在针对多种目标序列的LAMP反应中，反应体系内往往含有十余条引物。复杂引物间的非特异性杂交极大干扰了检测的准确度。这意味着单纯的LAMP技术难以实现多重病原菌同时检测。为解决这一问题，许多研究将微流控芯片（Microfluidicchip）与LAMP技术结合起来。微流控芯片技术的引入不仅能够将针对每一个目标序列的LAMP反应分割成独立单元，而且实现了小型化，便携化。但目前存在的此类芯片往往需要反应液的手动注入，这极易造成操作误差，进而影响检测结果。一种基于PDMS材料高气溶性的自动进样方式为此提供了新的思路。在真空环境下，溶解于PMDS芯片中的气体能够被抽出。当芯片重新放置于正常大气压下，气体会重新溶入PDMS中。这个过程会产生较强的吸力，从而实现反应液的自动注入。而且气体溶回PDMS的过程会持续较长时间，足够反应液的完全注入。这种自吸式进样方式操作简单，且不需借助任何仪器，十分适用于在基层单位和缺乏专业人员的欠发达地区推广使用。目前，这一方法尚未被结合于基于LAMP的多通道病原菌检测微流控芯片。
技术实现思路
本专利技术目的是提供基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片及检测方法。基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，它包括：进样层1、反应层2和支撑层3；进样层1包括进样层Ⅰ（11）、防蒸发膜8和进样层Ⅱ（13），所述的进样层1中心设有进样口4，进样层Ⅱ（13）设有若干进样通道5；反应层2内设有若干反应室6，圆形滤纸片7设在反应室6内；进样层Ⅰ（11）、进样层Ⅱ（13）和反应层2为PDMS材料；进样口4通过进样通道5与反应室6相通；进样层1上设有封闭膜9；防蒸发膜8为含氟聚合物Novec；所述的进样通道5长3~5mm、宽200μm、高115μm；进样层1厚度约1.5mm，进样口的直径1mm，芯片尺寸为20×20×2.5mm3；所述的封闭膜9为胶带；支撑层3为玻璃；所述的反应室6为2-8个。基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片制备方法：1）进样层的制备加工进样通道的阳模，在该阳模上浇注PDMS；待固化后，表面旋涂含氟聚合物Novec形成纳米级防蒸发膜；晾干后，再在其表面浇注PDMS，固化；将上述复合物从阳模上小心揭下，于中心处打孔，制得进样层；2)反应层的制备在干净的硅片上浇注适量PDMS，固化后，揭下；打孔，形成反应室，将圆形滤纸片裁剪成放于其中；3)芯片的组装将反应层的一侧与玻璃支撑层封接；随后，反应层的另一侧与进样层的进样通道侧封接；封接时，要保证进样通道末端与反应室相连。基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的检测方法，它包括：1）将引物滴加到圆形滤纸片7上，晾干；放入反应室6中；组装芯片；2）使用封闭膜9密封进样口4；将芯片置于真空干燥机中，除气；3）使用移液器吸取LAMP反应液，将吸有反应液的吸头刺入封闭膜9，在气压的驱动下，反应液被自动吸入芯片；随后，在吸头内的反应液液面上方注入密封油；反应液完全进入芯片后，密封油也会随之进入，并封闭进样通道，从而达到防止反应室间交叉污染和防止反应液蒸发的作用；待反应液全部进入反应室，且密封油充满进样通道时，拔去吸头，重新使用封闭膜9封闭进样口4；4）处理后的芯片放置在加热板上，60-70℃恒温反应0.5-2小时。所述的芯片为权利要求1所述的微流控芯片；所述的引物为6条对应金黄色葡萄球菌SA特征序列的LAMP引物，F3-nuc：TGGCTATCAGTAATGTTTCGAB3-nuc：TTAATTAATGTCGCAGGTTCTTLF-nuc：GTTAACACTAAGCAACTAGLB-nuc：CGGCGTAAATAGAAGTGATTCTGAAFIP-nuc：GAGCTACTTAGACTTGAAGCTACAACAAAGAGGTTTTTCTTTTTCGCBIP-nuc：GCAAATGCATCACAAACAGGTAATTTTAGTTGAAGTTGCACTGTA；所述的引物为6条对应副溶血性弧菌VP特征序列的LAMP引物，F3-tlh：AGCTACTCGAAAGATGATCCB3-tlh：GGTTGTATGAGAAGCGATTGLF-tlh：ACCAGTAGCCGTCAATGLB-tlh：TTAGATTTGGCGAACGAGAFIP-tlh：ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGTBIP-tlh：ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG；LAMP反应液为：8μL，含有如下成分：0.8M甜菜碱，1.4mMdNTP溶液，0.8μL10×等温扩增缓冲液，6mM硫酸镁溶液，0.16μL10×SYBRGreenI荧光染料，300μM羟基萘酚蓝溶液，2.56UBst2.0热启动DNA聚合酶，1.6μL样品DNA提取液。本专利技术提供了基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，它包括：进样层1、反应层2和支撑层3；进样层1包括进样层Ⅰ（11）、防蒸发膜8和进样层Ⅱ（13），所述的进样层1中心设有进样口4，进样层Ⅱ（13）设有若干进样通道5；反应层2内设有若干反应室6，圆形滤纸片7设在反应室6内；进样层Ⅰ（11）、进样层Ⅱ（13）和反应层2为PDMS材料；进样口4通过进样通道5与反应室6相通；进样层1上设有封闭膜9；防蒸发膜8为含氟聚合物Novec；以及微流控芯片在病原菌检测方面的应用；本专利技术优点在于：将微流控芯片技术与LAMP技术相结合，克服了传统LAMP反应难以进行多目标物同时检测的劣势；利用PDMS材料高气溶性的特质，实现了不借助任何仪器的自动进样，避免了手工进样引起的操作误差，简化了芯片的操作步骤；实现多重病原菌同时检测。附图说明图1基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的立体示意图（以三通道芯片为例）；图2基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的实物图（三通道芯片）；图3基于LA本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，它包括：进样层（1）、反应层（2）和支撑层（3）；进样层（1）包括进样层Ⅰ（11）、防蒸发膜（8）和进样层Ⅱ（13），所述的进样层（1）中心设有进样口（4），进样层Ⅱ（13）设有若干进样通道（5）；反应层（2）内设有若干反应室（6），圆形滤纸片（7）设在反应室（6）内；进样层Ⅰ（11）、进样层Ⅱ（13）和反应层（2）为PDMS材料；进样口（4）通过进样通道（5）与反应室（6）相通；进样层（1）上设有封闭膜（9）。

【技术特征摘要】
1.基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，它包括：进样层（1）、反应层（2）和支撑层（3）；进样层（1）包括进样层Ⅰ（11）、防蒸发膜（8）和进样层Ⅱ（13），所述的进样层（1）中心设有进样口（4），进样层Ⅱ（13）设有若干进样通道（5）；反应层（2）内设有若干反应室（6），圆形滤纸片（7）设在反应室（6）内；进样层Ⅰ（11）、进样层Ⅱ（13）和反应层（2）为PDMS材料；进样口（4）通过进样通道（5）与反应室（6）相通；进样层（1）上设有封闭膜（9）。2.根据权利要求1所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：防蒸发膜（8）为含氟聚合物Novec。3.根据权利要求2所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：所述的封闭膜（9）为胶带；支撑层（3）为玻璃。4.根据权利要求1、2或3所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：所述的反应室（6）为2-8个。5.根据权利要求4所述的基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，其特征在于：所述的进样通道（5）长3~5mm、宽200μm、高115μm；进样层（1）厚度约1.5mm，进样口（4）的直径1mm，芯片尺寸为20×20×2.5mm3。6.基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片制备方法：1）进样层的制备加工进样通道的阳模，在该阳模上浇注PDMS；待固化后，表面旋涂含氟聚合物Novec形成纳米级防蒸发膜；晾干后，再在其表面浇注PDMS，固化；将上述复合物从阳模上小心揭下，于中心处打孔，制得进样层；2)反应层的制备在干净的硅片上浇注适量PDMS，固化后，揭下；打孔，形成反应室，将圆形滤纸片裁剪成放于其中；3)芯片的组装将反应层的一侧与玻璃支撑层封接；随后，反应层的另一侧与进样层的进样通道侧封接；封接时，要保证进样通道末端与反应室相连。7.基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片的检测方法，它包括：1）将引物滴加到圆形滤纸片（7）上，晾干；放入反应室（6）中；组装芯片；2）使用封闭膜（9）密封进样口（4）；将芯片置于真空干燥机中，除气；3）使用移液器吸取LAMP反应液，将吸有反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娟，庞博，赵超，牟颖，徐坤，宋秀玲，王娟，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22