一种甜叶菊愈伤组织的获得方法技术

本发明专利技术属于植物细胞培养领域，具体涉及一种甜叶菊愈伤组织的获得方法。本发明专利技术提供的甜叶菊愈伤组织的获得方法包括将甜叶菊的气孔保卫细胞加以诱导培养、悬浮培养和愈伤组织诱导培养的步骤。本发明专利技术提供的甜叶菊愈伤组织的获得方法可以快速获得大量的表皮片段(含有气孔保卫细胞)，快速建立高纯度的悬浮细胞培养体系，缩短细胞筛选及培养时间，获得的愈伤组织质量高，胚性愈伤组织的百分率高，增重快。

A method for obtaining callus from Chrysanthemum

The invention belongs to the field of plant cell culture, in particular to a method for obtaining the callus of Stevia. The method for obtaining callus from Chrysanthemum comprises the steps of inducing and culturing stomatal guard cells, suspension culture and callus induction and culture of Stevia. The method of obtaining callus from chrysanthemum can quickly obtain a large number of epidermal fragments (containing stomatal guard cells), quickly establish high purity suspension cell culture system, shorten cell screening and culture time, obtain high callus quality, high percentage of embryogenic wound tissue, and faster weight gain.

【技术实现步骤摘要】
一种甜叶菊愈伤组织的获得方法
本专利技术属于植物细胞培养领域，具体涉及一种甜叶菊愈伤组织的获得方法。
技术介绍
甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)是菊科甜叶菊属植物，原产南美洲的巴拉圭，1976年从日本引进中国。现在，我国已成为世界上甜叶菊种植面积最大的国家，在江苏、福建、广东、浙江、山东、河南、安徽、新疆等地均有大面积种植。甜叶菊叶片富含甜叶菊糖苷、甜度高(为蔗糖的350-400倍)、热量低(为蔗糖的1/300)、安全无毒、被誉为“世界第三健康糖源”。中国卫生部于1985年和1990年分别批准甜叶菊糖苷为不限量使用的天然甜味剂和医药用甜味剂辅料。此外，甜叶菊糖苷具有控制血糖、降低血压、促进新陈代谢的作用，亦有治疗糖尿病、肥胖症、调节胃酸、恢复神经疲劳之功效。甜叶菊还可提升家畜、赛马和宠物食欲，治疗动物慢性病及牛不孕症，在畜牧和饲料生产上具有潜在应用价值。甜叶菊因种子极小、千粒重低(约0.02g)，不宜于实生苗繁殖。组培快繁和悬浮细胞培养成为甜叶菊糖工厂化生产的主要措施。国内外早在二十世纪开展了甜叶菊离体培养研究，从种子、茎尖、叶片、叶柄和茎段等外植体均诱导出了愈伤组织。Ferreia等(FerreiraM.C，HandroW.Production，maintenanceandplantregenerationfromcellsuspensionculturesofSteviarebaudiana(Bert.)Bertoni.1988PlantCellReports，7(2):123-126)采用从甜叶菊诱导的愈伤组织建立悬浮培养，提高了甜叶菊细胞的繁殖速度；利用甜叶菊的悬浮细胞培养，有可能实现大规模工厂化生产甜叶菊糖苷。选用适宜的胁迫培养基，还能够提高悬浮细胞的甜叶菊糖苷含量5％以上。然而，甜叶菊愈伤组织的细胞类型混杂，特别是分裂能力和生长速度的差异大，需要很长的培养周期，才能筛选出纯度高、分裂力强、增殖速度快的悬浮细胞系。国内对甜叶菊细胞悬浮培养的研究和报道非常少，因此，研发有关快速建立高纯度、高含量甜叶菊糖苷悬浮培养细胞系的新技术是非常必要的。气孔是植物与外界环境进行气体和水分交换的主要通道，通常由2个保卫细胞组成。保卫细胞多呈等径形、大小相近、核质比率大、胞质浓厚、细胞高度纯合，是建立悬浮细胞培养的理想外植体。然而，保卫细胞长期以来被认为是终端分化的特异细胞，丧失了分裂能力。目前，有关甜叶菊叶片气孔保卫细胞的分离和离体培养，国内外均无报道。目前的科研和实践中，均需要一种分离效率高、获得的细胞纯度高、悬浮培养细胞系的组建周期短的甜叶菊气孔保卫细胞的培养方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种甜叶菊愈伤组织的获得方法，该方法利用甜叶菊的气孔保卫细胞的分裂能力，将气孔保卫细胞经组织培养形成愈伤组织。一种甜叶菊愈伤组织的获得方法，该方法包括将甜叶菊的气孔保卫细胞加以诱导培养、悬浮培养和愈伤组织诱导培养的步骤。在优选的实施方式中，所述诱导培养包括将甜叶菊的表皮片段在诱导培养基中进行诱导培养，以获得小细胞团的操作；其中，所述诱导培养基为：以B5基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.5-5mg/L，添加NAA至终浓度为0.05-0.5mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度为100-200mg/L。在优选的实施方式中，所述悬浮培养包括将经过所述诱导培养获得的小细胞团在悬浮培养基中进行悬浮培养的操作；其中，所述悬浮培养基为：以B5基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.05-0.50mg/L，添加NAA至终浓度为0.5-5mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度为100-200mg/L。在优选的实施方式中，所述愈伤组织诱导培养包括将经过所述悬浮培养获得的小细胞团在愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养的操作；其中，所述愈伤组织诱导培养基为：以MS基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.1-3.0mg/L，添加NAA至终浓度为0.5-5mg/L，添加琼脂至最终的重量百分含量为0.4％-1.0％。在优选的实施方式中，所述诱导培养在无光照条件下进行，培养的温度为20-30℃；所述诱导培养的培养密度为0.1-1mLPCV/mL培养基。在优选的实施方式中，所述诱导培养还包括两次添加加液培养基的操作；其中，第一次添加加液培养基的操作为：在所述诱导培养的第7-10天，按照加液培养基和诱导培养基的体积比为(0.5-5):10的比例向诱导培养基中加入加液培养基；第二次添加加液培养基的操作为：在所述诱导培养的第15-21天，按照加液培养基和诱导培养基的体积比为(1-5):10的比例向诱导培养基中加入加液培养基；其中，所述加液培养基为：以B5基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.2-1.0mg/L，添加NAA至终浓度为0.2-0.8mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度为100-200mg/L。在优选的实施方式中，所述悬浮培养在无光照条件下进行，培养的温度为20-30℃，培养周期为7-8天，共培养2-6个周期；在优选的实施方式中，所述悬浮培养为震荡培养。在优选的实施方式中，所述愈伤组织诱导培养的操作为：首先在22-28℃、无光照条件下培养7-21天，然后转移至光照条件下继续培养20-45天。在优选的实施方式中，所述光照条件下培养的条件为：光照强度为500-1500LUX，光照时间14-18小时/天。相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术利用植物组织分离器，从甜叶菊组培植株的叶片分离出大量的表皮片段(含有气孔保卫细胞)，其分离效率比手工分离法提高40-50倍，时间缩短20-30倍。2、本专利技术首次发现甜叶菊的气孔保卫细胞具有分裂能力，经过诱导培养、悬浮培养和愈伤组织诱导培养的操作，建立了一整套有关保卫细胞的诱导、分裂、细胞团形成、愈伤组织生长及发育的离体培养方法及操作程序，为获得甜叶菊的愈伤组织开拓了一条新途径。3、本专利技术进一步利用甜叶菊保卫细胞产生的小细胞团，快速建立了高纯度的悬浮细胞培养体系，缩短细胞筛选及培养时间2-3倍，为该物种的生物发酵及菊糖苷等有益代谢产物的提取提供了一种新方法。4、与其他现有技术相比较，本专利技术的分离效率好(比手工法提高20-30倍)、获得的细胞纯度高(比其他方法高5-6倍)、悬浮培养细胞系的组建周期短(比其他方法缩短2-3倍)，技术独特，快捷实用。5、本专利技术利用从气孔保卫细胞诱导培养得到的小细胞团直接建立成为悬浮培养，避免了长时间的愈伤组织诱导、筛选及纯化过程，大大缩短了细胞团选择及培养的时间，比其他的细胞来源和筛选方法缩短3-6个月；此外，悬浮保卫细胞的群体比采用愈伤组织诱导的悬浮细胞系更加纯合和稳定。6、本专利技术的各个步骤和参数之间协同作用，共同进一步提高了保卫细胞形成的愈伤组织的数量和质量。本专利技术的其他特征和优点将在如下的具体实施方式部分详细描述。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为实施例1中分离获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甜叶菊愈伤组织的获得方法，该方法包括将甜叶菊的气孔保卫细胞加以诱导培养、悬浮培养和愈伤组织诱导培养的步骤。

【技术特征摘要】
1.一种甜叶菊愈伤组织的获得方法，该方法包括将甜叶菊的气孔保卫细胞加以诱导培养、悬浮培养和愈伤组织诱导培养的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述诱导培养包括将甜叶菊的表皮片段在诱导培养基中进行诱导培养，以获得小细胞团的操作；其中，所述诱导培养基为：以B5基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.5-5mg/L，添加NAA至终浓度为0.05-0.5mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度为100-200mg/L。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述悬浮培养包括将经过所述诱导培养获得的小细胞团在悬浮培养基中进行悬浮培养的操作；其中，所述悬浮培养基为：以B5基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.05-0.50mg/L，添加NAA至终浓度为0.5-5mg/L，添加谷氨酰胺至终浓度为100-200mg/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述愈伤组织诱导培养包括将经过所述悬浮培养获得的小细胞团在愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养的操作；其中，所述愈伤组织诱导培养基为：以MS基本培养基为基础，添加蔗糖至最终的重量百分含量为2％-4％，添加6-BA至终浓度为0.1-3.0mg/L，添加NAA至终浓度为0.5-5mg/L，添加琼脂至最终的重量百分含量为0.4％-1.0％。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏潮，张秀海，陈绪清，杜运鹏，
申请(专利权)人：北京农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11