结合有工业意义的小分子的肽结构域制造技术

本发明专利技术涉及结合有工业意义的小分子的肽结构域。本文阐述结合有工业意义的小靶标分子的小肽结构域和共有序列，所述有工业意义的小靶标分子例如金属例如镍、β胡萝卜素和异黄酮例如染料木黄酮。同样阐述含有所述结合结构域的融合蛋白，所述结合结构域与蛋白质或与肽结构域例如GST或CBD融合，所述蛋白质或肽结构域结合其它配体，可用于将所述靶标结合结构域固定在支持体上。可用于工业环境的融合蛋白中的一类是含有靶标结合结构域串联体的融合体，所述融合体增加每分子的结合当量。

【技术实现步骤摘要】
结合有工业意义的小分子的肽结构域相关申请的交叉引用本申请是国际申请日为2011年1月28日的国际申请PCT/US2011/023030进入中国、申请号为201180016922.6的题为“结合有工业意义的小分子的肽结构域”的专利技术专利申请的分案申请。本申请要求于2010年1月29日提交的美国专利申请序列号61/299,449的申请日权益，其公开内容通过引用并入本文中。技术邻域和
技术介绍
一直在将能够结合特异性靶标分子的肽用于生物学、医学、制药领域的各类研究和产品开发工作中。在这些领域中，靶标分子通常是具有生物学意义的分子，例如病变细胞或致病细胞的肽表位、表面受体蛋白、信号转导蛋白、在生物学应答例如免疫T细胞和B细胞应答的病因学中涉及的蛋白质和用于生物学研究的靶标，例如与核酸结合的蛋白质或为鉴定和筛选目的需要特异性结合配体的生物学感兴趣的其它蛋白质。为获得具有特定靶标结合活性的肽而最长期使用的工具来自对免疫反应的开发，最初是通过获得多克隆抗体，例如通过注射靶标分子攻击动物以获得B细胞应答来诱导IgG和IgM，并从血液中分离抗体。随后，从杂交瘤细胞克隆中获得单克隆抗体，所述杂交瘤细胞克隆产生结合靶标分子的特定表位的单一种类的抗体。有用的抗体具有以通常为10-7M或更小、更通常为10-8M-10-9M的摩尔解离常数(Kd)结合靶标分子的能力。这些技术完全依靠开发天然生物免疫系统，所述系统能够重组抗体高可变结构域的编码序列以产生极为多样化的抗体，并具有天然刺激与目的靶标分子结合的少量抗体增殖的能力。就单克隆抗体而言，天然诱导的增殖被人为的选择和培养表达特异性抗体的克隆的能力所取代。尽管已经证明使用抗体成为用于获得结合特定靶标分子的肽的强大工具，但抗体的工业应用的效用受到限制。首先，抗体必须由全血、鸡蛋或杂交瘤组织培养物制备，与结合靶标分子的工业规模需求相比，所有这些都是昂贵而低产量的生产系统。其次，它们依赖在抗体分子高可变区形成的结合结构域的三维结构，这需要生产相当大的蛋白质(即使是单链可变片段情况下)，以获得结合每一摩尔靶标分子所需的相对较小的肽结构域的1摩尔结合当量。最近，用于鉴定靶标结合结构域的抗体的较新的备选品是开发细菌蛋白展示系统，最值得注意的是噬菌体展示系统。这些系统以与表面蛋白的融合蛋白的形式来展示肽或整个蛋白的序列，例如对于噬菌体展示，将肽表达为与噬菌体颗粒蛋白的融合蛋白。噬菌体展示是用于探索组合随机肽文库的序列空间的最强大和完善的技术之一。通常外源蛋白/肽作为与次要外壳蛋白pIII或主要外壳蛋白pVIII的融合蛋白表达于M13噬菌体表面上。可针对靶标分子(固定在珠粒上或吸附于微量滴定板孔中)筛选具107-1011多样性肽(具有5-40个残基)的文库，经过结合和感染的反复轮次富集特定的结合物。通过ELISA检测富集池中单个克隆的结合，通过测定噬菌体颗粒中的DNA序列来解码结合肽的氨基酸序列。然后可将肽配体的氨基酸序列与蛋白质数据库比较，以计算机鉴定潜在的内源互作蛋白。噬菌体展示技术主要用于鉴定蛋白质-蛋白质、蛋白质-肽和蛋白质-DNA的相互作用，因此，尤其用作鉴定靶标肽的研究工具，所述靶标肽与生理学重要的蛋白例如抗体和受体相互作用，或与特定DNA序列结合，或与潜在候选药物结合以便发现用于药物应用的潜在生理学靶标蛋白。然而，很少将噬菌体展示用于鉴定与有工业意义的小分子结合的肽，所述有工业意义的小分子例如在工业生产液流中的污染物或金属离子。尽管作为研究工具有用，但一直未显示噬菌体展示作为实际生产用于在任何工业加工或产品方面的商业部署的肽结构域的工具的实用性。然而，业已阐述少数金属结合肽。在金属结合肽中发现的一种金属结合基序为6个组氨酸(“多组氨酸”)的序列，已知其能够结合镍。可获得含有其中启动子与编码含多组氨酸的肽的区域连接的核酸序列的表达载体，以制备所谓的“组氨酸-标签”融合蛋白，所述融合蛋白可通过依靠多组氨酸结构域结合固定在柱上的镍的能力自细胞提取物中快速分离。用过量咪唑从柱中洗脱结合的蛋白。如果克隆载体在融合蛋白框架内另外编码蛋白酶底物位点，则可用蛋白酶将多组氨酸结合结构域自洗脱蛋白裂解。最为人知晓的多组氨酸结合结构域是包含6个组氨酸核心序列的肽，如以序列YSHHHHHHLAGTA(SEQIDNO：1)为例所示，其对镍的摩尔解离常数为2.3x10-11M。另外一种已知多组氨酸结合结构域为组氨酸-谷氨酰胺二肽的6聚体重复的12个氨基酸的肽，即(HQ)6(SEQIDNO：2)，精氨酸也表明是在镍结合中起重要作用的氨基酸残基，因为亦显示共有序列RHXHHR(SEQIDNO：3)(其中X最常为组氨酸)以高亲和力结合镍(Jie等，ChemicalBiology&DrugDesign(2006)68：107-112)。Jie等人通过筛选形成经工程改造以在鞭毛上展示蛋白的细菌文库的肽鉴定了该序列，并提示展示所述序列的细菌可能用作生物衍生的废水修复剂(remediationagent)。Behnaz等人(IranianJournalofBiotechnology(2005)3：180-185)用相似的系统揭示结合金属的肽的极为不同的基序，其显示经由纤毛(fibrinea)融合蛋白展示于大肠杆菌(E.coli)表面上的富半胱氨酸肽GCGCPCGCG(SEQIDNO：4)，能够以相对次序铅＞镉＞镍结合金属。关于半胱氨酸，显示通过与OmpX膜蛋白融合在其表面展示含半胱氨酸肽LCCYWSYSRMCKN(SEQIDNO：5)(选自随机产生的11-聚体文库，11-聚体中，2个半胱氨酸被7个氨基酸分开且每一个侧翼有2个氨基酸)的大肠杆菌，与悬浮液中的金颗粒结合(Kaviani，BiologicalApplicationsNNINREU(2006)ResearchAccomplishments，第12-13页)。通过噬菌体展示用M13鉴定了序列LKAHLPPSRLPS(SEQIDNO：6)的含脯氨酸/羟基金结合肽(Nam等，Science(2006)312：885-888)。同样地但在不相关的工作中显示，通过噬菌体表面展示鉴定的几个富含羟基但没有特定共有序列的肽结合铝，其中肽VPSSGPQDTRTT(SEQIDNO：7)显示特别强的结合(Zao等，Appl.Microb.andBiotech.(2005)68：505-509)。业已提议金结合肽可能用于微电子纳米结构的组装。其他人证明在M13噬菌体文库上展示的金属结合肽可用作改进催化活性的生物模板催化剂(Nelner等，ACSNano(2010)4：3227-3235)。尽管有这些建议，但是单独的噬菌体展示或其它细菌展示系统还不适于在实际工业规模处理中部署，所述实际工业规模处理例如水修复、回收贵重金属或从工业生产液流中去除污染物。这是因为结合工业规模工业生产液流中的靶标分子所需的结合位点的量非常大。举例而言，经由细菌细胞培养物产生的典型噬菌体滴度大约为1012颗粒/mL。即使假定每个颗粒展示103个结合蛋白，每个蛋白结合一当量靶标分子，这需要6.02x108mL或602,000升细胞培养物以产生足够多的颗粒仅仅结合1摩尔靶标分子。1摩尔镍是60g的材料，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的融合多肽或分离的肽，其包含具有下式核心序列的金属结合肽：H‑X‑H‑(Z')‑H‑(Z")‑H(SEQ ID NO:116)其中H为组氨酸；X为选自以下的单个氨基酸：天冬酰胺、精氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸和异亮氨酸；Z'为甘氨酸或色氨酸，Z”为1‑4个氨基酸，其中当Z”为1个氨基酸时，该氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、苏氨酸和亮氨酸，以及其中当Z”为2‑4个氨基酸时，至少一个氨基酸选自天冬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸和组氨酸；其中在所述核心序列的1‑5个残基里面存在不多于2个的以下残基：天冬氨酸和谷氨酸二者，或赖氨酸和精氨酸二者，或不多于4个天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸残基；其中所述肽以9.0x10

【技术特征摘要】
2010.01.29 US 61/2994491.一种分离的融合多肽或分离的肽，其包含具有下式核心序列的金属结合肽：H-X-H-(Z')-H-(Z")-H(SEQIDNO:116)其中H为组氨酸；X为选自以下的单个氨基酸：天冬酰胺、精氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸和异亮氨酸；Z'为甘氨酸或色氨酸，Z”为1-4个氨基酸，其中当Z”为1个氨基酸时，该氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、苏氨酸和亮氨酸，以及其中当Z”为2-4个氨基酸时，至少一个氨基酸选自天冬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸和组氨酸；其中在所述核心序列的1-5个残基里面存在不多于2个的以下残基：天冬氨酸和谷氨酸二者，或赖氨酸和精氨酸二者，或不多于4个天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸残基；其中所述肽以9.0x10-11M或小于9.0x10-11M的解离常数结合金属，前提为不多于5个组氨酸残基出现在SEQIDNO:116中。2.权利要求1的分离的融合多肽或分离的肽，其中Z"不含有谷氨酰胺。3.权利要求1或2的分离的融合多肽或分离的肽，其中至少一个脯氨酸、酪氨酸或色氨酸在所述核心序列的1-5个残基里面。4.权利要求1的分离的融合多肽或分离的肽，其中X为精氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸或异亮氨酸。5.权利要求1的分离的融合多肽或分离的肽，其中Z'是甘氨酸，或Z”包括丙氨酸、精氨酸或苏氨酸。6.权利要求1-5中任一项的分离的融合多肽或分离的肽，其中所述肽结合选自镍、锌和铜的金属。7.权利要求1-6中任一项的分离的融合多肽或分离的肽，其融合到多于12个氨基酸的多肽序列。8.权利要求7的分离的融合多肽或分离的肽，其中所述多肽序列进一步含有配体结合结构域，所述配体结合结构域结合不是金属的配体。9.权利要求1的分离的融合多肽或分离的肽，其包含具有核心序列的至少两个金属结合结构域，其中所述至少两个金属结合肽的核心序列不相同。10.权利要求1的分离的融合多肽或分离的肽，其包含具有核心序列的至少两个金属结合结构域，其中所述至少两个金属结合肽的核心序列相同。11.权利要求1-10任一项的分离的融合多肽或分离的肽，其中所述分离的融合肽是分离的融合多肽。12.权利要求1-10任一项的分离的融合多肽或分离的肽，其中所述核心序列是SEQIDNO:9、SEQIDNO:11或SEQIDNO:101中的核心序列。13.一种分离的肽，其包含天然或非天然存在的多肽或肽和至少一个金属结合肽的融合体，其中所述至少一个金属结合肽的序列包含下式核心序列：H-X-H-(Z')-H-(Z")-H(SEQIDNO:116)其中H为组氨酸；X为选自以下的单个氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：TP宾德，AG劳，山本康文，P汉克，
申请(专利权)人：阿切尔丹尼尔斯密德兰公司，衣阿华州立大学研究基金公司，
类型：发明
国别省市：美国,US