具有提高的灵敏度的免疫检定制造技术

本发明专利技术涉及提高免疫检定的灵敏度的方法。本发明专利技术利用酸洗脱条件，其优选地从固相中相对于非特异性结合的免疫复合物洗脱特异性结合的免疫复合物，并且设计提高特异性结合与非特异性结合的比率并且由此提高检定灵敏度的免疫检定方案。所述方案测定从固相中洗脱的标记的免疫复合物的信号。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有提高的灵敏度的免疫检定
技术介绍
提高免疫检定灵敏度已为发展活体外诊断性检验的长期目标。灵敏生物标记测量对于患者治疗类选法中的早期疾病检测和成本效益的益处在文献中有充分记载。随时间已在数代中提供多种临床检定，其中每一后续迭代具有改良的灵敏度的特征。肌钙蛋白I免疫检定为一个此类实例，其中高灵敏度版本代表现有技术水平。几个临床因素造成驱使采用高度灵敏的肌钙蛋白I(hsTnl)检定。人们认识到正常患者具有在个位数pg/ml范围内的循环的、低含量的TnI。第二，轻微的心脏病发作具有与正常值非常类似的TnI含量。因此，在正常范围内检测TnI的能力至关重要。Apple(Clin.Chem.，55：1303-1306，2009)报道了hsTnI检定的指定重点在于用正常样品进行。图1展示hsTnI检定必须满足的参数。高于50％的正常值必须被检测到，并且在第99个百分位的正态分布处的不精确性必须＜10％以在准则是可接受的，或为10-20％以在临床上适用。图2说明具有捕捉抗体和标记抗体的典型夹心免疫检定模式，其中将捕捉抗体固定于固相上。存在两种基本类型的通过标记抗体的结合。当标记抗体与固相上的抗原形成复合物时，免疫-特异性结合发生。因为它能够实现抗原检测，所以这为相关特异性结合。第二种类型的结合为非特异性的，其中标记抗体不经特异性抗原而与固相结合。被配置成夹心免疫检定的每一种固相具有特异性与非特异性结合的某一组合。用高灵敏度的免疫检定，在低抗原含量下特异性与非特异性结合的比率变得至关重要。因此，高灵敏度检定的开发人员力求使特异性结合最大化同时寻求使非特异性结合减到最少的方式。附图说明图1展示基于正常值高度灵敏的肌钙蛋白I(hsTnl)必须满足的参数。图2说明典型固相夹心免疫检定模式。AB＝抗体，AG＝抗原。图3说明荧光检测系统的一个实施例，其在探针头上检测荧光。图4说明替代性的荧光检测系统。具有宽激光束和聚光透镜的数值孔径的光学器件检测液相中的洗脱标记抗体。图5说明一种检测液体样品中的分析物的方法，所述方法在直接抗体结合检定中使用荧光标记抗体和酸洗脱方案。通过从探针上的第一荧光信号读数中减去探针上的第二荧光信号读数计算洗脱物质的荧光信号。Ab：抗体。图6说明一种检测液体样品中的分析物的方法，所述方法在扩增检定中使用结合对和具有多个荧光标记的高分子量聚合物。Ag：抗原，AB：抗体；B-AB：生物素(biotin)-抗体；Cy5-SA：Cy5-抗生蛋白链菌素(Streptavidin)。图7说明一种在循环扩增检定中检测液体样品中的分析物的方法，图7与图6类似，除了图7具有提高灵敏度的额外的循环扩增步骤。具体实施方式定义申请专利范围和说明书中所用的术语除了并且如下文所阐述的定义由本领域的普通技术人员根据他们的常用含义理解。如本文所用，术语“约”是指在所述值的±10％内。如本文所用，“分析物结合”分子是指能够参与与分析物分子的特异性结合反应的任何分子。实例包括但不限于，(i)抗原分子，以用于检测特异性针对其抗原的抗体的存在；(ii)抗体分子，以用于检测抗原的存在；(iii)蛋白质分子，以用于检测其蛋白质的结合伴侣的存在；(iv)配体，以用于检测结合伴侣的存在；或(v)单链核酸分子，以检测核酸结合分子的存在。形状的“纵横比”是指其较长尺寸与其较短尺寸的比率。“结合分子”是指能够结合所关注的另一分子的分子。如本文所用，“结合对”是指彼此吸引并且具体来说与彼此结合的两个分子。结合对的实例包括但不限于：抗原和针对抗原的抗体、配体和其受体、互补核酸链、生物素和抗生物素蛋白(avidin)、生物素和抗生蛋白链菌素、生物素和中性抗生物素蛋白(抗生物素蛋白的脱糖基化形式)、凝集素(lectin)和碳水化合物。优选的结合对为生物素和抗生蛋白链菌素、生物素和抗生物素蛋白、生物素和中性抗生物素蛋白、荧光素和抗荧光素、洋地黄毒苷(digoxigenin)/抗洋地黄毒苷以及DNP(dinitrophenol，二硝基苯酚)和抗DNP。如本文所用，“分支聚合物”是指具有2维或3维结构的非线性聚合物，其可为天然存在的分支聚合物或合成的交联聚合物。如本文所用，“化学发光”是指由于化学反应发射有限光发射的能量。举例来说，当鲁米诺(luminol)与过氧化氢在合适的催化剂存在下反应时，它产生呈激发态的3-氨基邻苯二甲酸，其在它衰减到较低能级时发射光。如本文所用，“电化学发光”(electrochemiluminescence，ECL)是指在溶液中电化学反应期间产生的发光。在ECL中，电化学产生的中间物经历高度放能反应以产生电子激发态并且随后发射光，ECL激发由电致物种的高能电子转移(氧化还原)反应引起。通常在将电势(几伏)施加到含有发光物种的溶液的电化学电池的电极期间观察到ECL。如本文所用，“固定”是指被固定到固体表面上的试剂。当试剂被固定到固体表面上时，它被非共价结合或共价结合到表面上。如本文所用，“单块衬底”是指单一块固体材料，如具有一种折射率的玻璃、石英或塑料。如本文所用，“探针”是指在感测面用分析物结合分子的薄膜层涂布的固相衬底。探针具有末端和近端。近端(也是指本申请案中的探针头)具有用分析物结合分子的薄层涂布的感测表面。本专利技术涉及一种在免疫检定中增加信背比并且因此提高检定灵敏度的方法。本专利技术人已发现，从固相中洗脱特异性免疫复合物的条件不同于洗脱非特异性复合物的条件。本专利技术人已发现洗脱条件，其优选地从固相中洗脱非特异性复合物内的特异性免疫复合物，并且随后设计提高特异性结合与非特异性结合的测量比率并且由此提高检定灵敏度的免疫检定方案。本专利技术通过在它结合到固相上之后测定从固相中洗脱的标记免疫复合物的信号来检测分析物。荧光检测系统本专利技术可使用任何合适的发光检测系统。在一个实施例中，本专利技术使用与在美国专利第8,492,139号(其以全文引用的方式并入本文中)中描述的类似的荧光检测系统以测量探针头上的荧光信号。所述系统包含：(a)长度与宽度的纵横比为至少5比1的探针，所述探针具有第一端和第二端，第二端具有与荧光标记结合的感测表面；(b)将激发光直接发射到探针的感测表面上的光源；(c)指向感测表面的聚光透镜；和(d)用于检测发射荧光的光检测器；其中聚光透镜收集发射荧光并且引导到光检测器上。探针可为单块衬底或光纤。探针可为任何形状，如条形、圆柱形、圆形、正方形、三角形等，其中长度与宽度的纵横比为至少5比1，优选的是10比1。因为在免疫检定期间探针浸渍于样品溶液和一种或多种检定溶液中，期望具有纵横比为至少5比1的长探针以使探针头浸没到溶液中。探针的感测表面用分析物结合分子涂布并且与荧光标记结合。对于荧光标记可发射适当激发光的任何光源适用于本专利技术。优选光源为可发射具有适于荧光标记的波长的光的激光。举例来说，针对Cy5荧光染料激光中心波长优选为649nm。用于检测发射光的合适光检测器为光电倍增管(photomultipliertube，PMT)、电荷耦合器件(chargecoupleddevice，CCD)或光电二极管。光源和包括聚光透镜的光检测器安放在探针头表面的相同面(感测表面)上。如果感测表面朝下，那么它们两者都安放在尖端表面下方。如果感测表面朝上，那么本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测液体样品中的分析物的方法，所述方法包含以下步骤：(a)将探针头浸渍到含有样品溶液的样品容器中以使分析物(如果存在)与所述探针头上的第一抗体结合，其中所述探针具有固定于所述探针的尖端的针对所述分析物的第一抗体；(b)将所述探针头浸渍到含有试剂溶液的试剂容器中，所述试剂溶液包含针对所述分析物的第二抗体，所述第二抗体与发光标记缀合以在所述探针头上在所述分析物、所述第一抗体和所述第二抗体当中形成免疫复合物；(c)将所述探针头浸渍到含有洗涤溶液的洗涤容器中；(d)将所述探针头浸渍于读取容器中并且测量结合于所述探针头上的物质的第一发光信号；(e)将所述探针头浸渍到pH为2.0‑5.0的洗脱液中以从所述探针头中洗脱物质；(f)将所述探针头浸渍于所述读取容器中并且测量结合于所述探针头上的物质的第二发光信号；(g)通过从所述第一发光信号中减去所述第二发光信号计算所述洗脱物质的发光信号，并且测定所述分析物的量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.26 US 62/210,3721.一种检测液体样品中的分析物的方法，所述方法包含以下步骤：(a)将探针头浸渍到含有样品溶液的样品容器中以使分析物(如果存在)与所述探针头上的第一抗体结合，其中所述探针具有固定于所述探针的尖端的针对所述分析物的第一抗体；(b)将所述探针头浸渍到含有试剂溶液的试剂容器中，所述试剂溶液包含针对所述分析物的第二抗体，所述第二抗体与发光标记缀合以在所述探针头上在所述分析物、所述第一抗体和所述第二抗体当中形成免疫复合物；(c)将所述探针头浸渍到含有洗涤溶液的洗涤容器中；(d)将所述探针头浸渍于读取容器中并且测量结合于所述探针头上的物质的第一发光信号；(e)将所述探针头浸渍到pH为2.0-5.0的洗脱液中以从所述探针头中洗脱物质；(f)将所述探针头浸渍于所述读取容器中并且测量结合于所述探针头上的物质的第二发光信号；(g)通过从所述第一发光信号中减去所述第二发光信号计算所述洗脱物质的发光信号，并且测定所述分析物的量。2.一种检测液体样品中的分析物的方法，所述方法包含以下步骤：(a)将探针头浸渍到含有样品溶液的样品容器中以使分析物(如果存在)与所述探针头上的第一抗体结合，其中所述探针具有固定于所述探针的尖端的针对所述分析物的第一抗体；(b)将所述探针头浸渍到含有试剂溶液的试剂容器中，所述试剂溶液包含针对所述分析物的第二抗体，所述第二抗体与发光标记缀合以在所述探针头上在所述分析物、所述第一抗体和所述第二抗体当中形成免疫复合物；(c)将所述探针头浸渍到含有洗涤溶液的洗涤容器中；(d)将所述探针头浸渍到含有pH为2.0-5.0的洗脱液的洗脱容器中以从所述探针头中洗脱物质；(e)从所述洗脱容器中去除所述探针头；(f)测量所述洗脱容器中的所述洗脱物质的发光信号，并且测定所述分析物的量。3.一种检测液体样品中的分析物的方法，所述方法按次序包含以下步骤：(a)将探针头浸渍到含有样品溶液的样品容器中以将分析物(如果存在)与所述探针头上的第一抗体结合，其中所述探针具有固定于所述探针的尖端的针对所述分析物的第一抗体；(b)将所述探针头浸渍到含有试剂溶液的试剂容器中，所述试剂溶液包含针对所述分析物的第二抗体的试剂，所述第二抗体与结合对的第一成员缀合以使所述试剂与所述分析物结合；(c)将所述探针头浸渍到含有第一洗涤溶液的第一洗涤容器中以洗涤所述探针头；(d)将所述探针头浸渍到含有扩增溶液的扩增容器中，所述扩增溶液包含分子量为至少1百万道尔顿并且与所述结合对的第二成员的至少5个分子和至少25个发光标记缀合的交联多醣以在所述探针头上形成所述分析物、所述第一抗体、所述第二抗体以及所述结合对的所述第一成员和所述第二成员的免疫复合物；(e)将所述探针头浸渍到含有第二洗涤溶液的第二洗涤容器中；(f)将所述探针头浸渍于读...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特·F·祖克，谭洪，夏青，李璞，陈浩德，吴衡，
申请(专利权)人：万迈医疗仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US