新型碱性蛋白酶变体及含有该新型碱性蛋白酶变体的洗涤剂和清洗剂制造技术

本发明专利技术涉及新型碱性蛋白酶变体，其源自天然或改良的枯草杆菌蛋白酶。与目前已知的枯草杆菌蛋白酶相比，该得自迟缓芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　　ｌｅｎｔｕｓ）枯草杆菌蛋白酶的变体具有两个氨基酸位置１９９Ｉ和２１１Ｇ，和至少一个有利于分子稳定的改良，特别是点突变后在位置３具有苏氨酸和／或在位置４具有异亮氨酸。作为例子，对变体迟缓芽孢杆菌－碱性蛋白酶Ｓ３Ｔ／Ｖ４Ｉ／Ｖ１９９Ｉ／Ｌ２１１Ｇ进行了研究。该变体与其他的蛋白酶－变体相比对洗涤剂和清洗剂的洗涤性能具有更大的作用。除该酶以外，本发明专利技术还涉及其在各种不同技术工艺中应用，特别是涉及含有该新型碱性蛋白变体的洗涤剂和清洗剂。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及源自于天然或改良枯草杆菌蛋白酶的新型碱性蛋白酶变体。根据迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)枯草杆菌蛋白酶的编号，所述变体与目前已知的枯草杆菌蛋白酶相比，具有两个氨基酸位置199I和211G，和至少一个有利于分子稳定的改良，优选在点突变后位置3的苏氨酸和/或位置4的异亮氨酸。特别优选的是变体迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶S3T/V4I/V199I/L211G。该变体与其他的蛋白酶变体相比在洗涤剂和清洗剂中具有更好的洗涤性能。除该酶以外，本专利技术还涉及其在各种不同技术工艺中的应用，特别涉及含有该新型碱性蛋白酶变体的洗涤剂和清洗剂。枯草杆菌蛋白酶型的蛋白酶(Subtilase，枯草杆菌肽酶，EC3.4.21.62)基于催化活性的氨基酸被归于丝氨酸蛋白酶。其是由微生物，特别是芽孢杆菌天然产生和分泌的。其起着非特异内肽酶的作用，也就是说它可水解任何位于肽或蛋白质内部的酰胺键。其最适pH大多处于明显的碱性范围。有关该家族的综述例如可见R.Bott和C.Betzel主编，New York，1996年出版的“Subtilisin enzymes”第75-95页由R.Siezen撰写的文章“Subtilases类枯草杆菌-蛋白酶(Subtilisin-likeProteases)”。枯草杆菌蛋白酶适合于多种可能的技术应用，特别是用作洗涤剂或清洗剂的活性成分。除例如淀粉酶，脂肪酶或纤维素酶的酶外，蛋白酶在数十年来已被广泛用作洗涤剂和清洗剂的活性成分。其具有将洗涤物如纺织品或器皿上所含蛋白的污渍加以分解的能力。水解产物由于其相对高的水溶性而随洗涤水一起冲走或被其他的洗涤剂或清洗剂的成分作用，溶解，乳化或悬浮。由此使得在酶与洗涤剂和清洗剂的其他成分之间产生协同作用。枯草杆菌蛋白酶基于其优良的酶解特性如稳定性或最适pH值使得其在洗涤剂和清洗剂蛋白酶中占据一突出的地位。在下述将列举目前在洗涤剂中应用的枯草杆菌蛋白酶，其部分是天然的分子，而部分是借助诱变由野生型酶获得的变体。在J.Bacteriol.第159卷，第811-819页Vasantha等人(1984)和在Nucleic acid Research，第11卷，第7911-7925页J.A.Wells等人(1983)的研究中已公开了分别来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，以及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的枯草杆菌蛋白酶BPN’。而在专利公布WO95/07991和WO95/30010中叙述了通过酶在环-区域的点突变所获得的变体，其与底物结合降低的同时提高了水解速率。例如在专利公布WO95/29979中公开了含有该BPN’-变体的洗涤剂。在本专利申请中所研究的两个氨基酸位置，即位置3和4，并不处于环-区域；如上述申请中的叙述，残基199和211分别与位于BPN’分子的第6环位置205以及217同源。所述环参与底物的结合。对BPN’而言，在位置205处天然地具有一异亮氨酸(I)。在公布WO95/07991中提出了大量可能用于替换天然在位置217上的酪氨酸(Y)的氨基酸，但均与分子的稳定突变无关；即使一217G突变被要求保护，也仅是与其他的在该底物-结合的环中催化补偿的点突变有关。唯一真正公开的在位置205和/或217上具有替换的变体(S.14)是，在其中两个残基已被空间充满的通常也是脂族氨基酸所替换。同样的情况见公布WO95/29979。在公布WO95/30010中的枯草杆菌蛋白酶，当其在第6环中具有一突变时，那末在不同环中至少具有另一个突变。作为217G变体公开的例子有Y217G/S188D或那些甚至带有多个非第6环的替换，其同源性氨基酸在本专利技术的变体中无改变。枯草杆菌蛋白酶BPN’用作枯草杆菌蛋白酶的参照酶，尤其涉及位置编号时。例如在申请EP130756中以BPN’的编号标出了所有枯草杆菌蛋白酶涉及的点突变。这些点突变也包括位置217，其对应于本专利技术酶的位置211。其他相关位置在该文中并未予以先行描述。蛋白酶枯草杆菌蛋白酶Carlsberg在J.Biol.Chem.，第243卷，第2184-2191页E.L.Smith等人(1968)和在Nucl.Acids Res.，第13卷，第8913-8926页Jacobs等人(1985)的出版物中进行了介绍。其天然来自于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和可从丹麦Novozymes A/S公司，Bagsvaerd以商品名Alcalase购得。通过点突变所获得的变体在提高水解率的同时对底物的结合减少，公开在例如公布WO 96/28566中。如同上所述及的BPN’申请，在这些变体的分子的环-区域中进行了一个或多个的替换；一变体204I/216G(Carlsberg编号)在其中未被预先述及。蛋白酶PB92天然产自于亲碱细菌Bacillus nov.spec 92和以商品名Maxacal从荷兰的Gist-Brocades公司，Delft获得。其原始序列已在专利申请EP 283075中述及。通过点突变所获得的所述酶的变体，适合应用于洗涤剂和清洗剂中的酶，在公布WO94/02618和EP 328229中公开。从这些申请的第一个中仅变体L211G/N212D具有一个与本文要求保护的变体相同的替换；而在第二个申请中没有相关的变体出现。枯草杆菌蛋白酶147和309被Novozymes公司分别以商品名Esperase以及Savinase销售。其来源于Bacillus clausii-菌株，在申请GB 1243784中作了公开。例如在公布WO89/06279，WO95/30011，WO99/27082和WO00/37599中公开了通过点突变开发的在洗涤剂和清洗剂中使用该酶的变体的情况。公布WO89/06279旨在对该蛋白酶达到较高的氧化稳定性，提高的蛋白水解率和改良的洗涤性能。由其(P.14)得出，只有在一定位置上进行替换才可使枯草杆菌蛋白酶147或309分子的物理或化学性质发生改变；这里未提及位置3，4或211。公布WO95/30011中描述了枯草杆菌蛋白酶309的变体，其在分子的环-范围内具有点突变和由此在水解率提高的同时显现对底物的吸附减少；这里未提及在位置3或4上的突变；唯一真正与本专利技术申请变体相对应的点突变是取代L211G，而其无论如何不可能与取代V199I相关联。在公布WO99/27082中，例如从枯草杆菌蛋白酶309中开发出了变体，并由此提高了其洗涤效果，通过一个以上氨基酸的插入使得该活性环被加大。其取代与本专利技术的不同。其他在洗涤剂和清洗剂中被使用的蛋白酶的例子有-得自芽孢杆菌的蛋白酶164-A1，Chemgen Corp.，Gaithersburg，MD，USA和Vista Chemical Company，Austin，TX，USA(WO93/07276)；-得自芽孢杆菌的碱性蛋白酶PD138 NCIMB 40338，Novozymes(WO93/18140)；-得自芽孢杆菌ferm.BP-3376的蛋白酶K-16，Kao Corp.，Tokyo，Japan(US 53444770)；-由Nedkov等人1985在Biol本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草杆菌蛋白酶型的碱性蛋白酶，其特征在于，根据迟缓芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）ＤＳＭ５４８３枯草杆菌蛋白酶的编号，其具有在位置１９９的异亮氨基酸和在位置２１１的甘氨酸以及至少一个稳定作用氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：贝娅特丽克丝克特维茨，卡尔海因茨毛雷尔，罗兰布雷韦斯，
申请(专利权)人：汉高两合股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]