一种萃仙菇杂交育种方法技术

本发明专利技术公开了一种萃仙菇杂交育种方法，具体步骤如下：（1）将白玉菇菌株与灰蟹菇菌株分别培养得到对应的适龄菌丝；（2）原生质体的制备与再生：无菌条件下，将步骤（1）所得适龄菌丝分别进行酶解处理，得到原生质体，纯化，加入原生质体再生培养液，封口培养；（3）挑取再生原生质体的尖端菌丝进行培养，并在无菌条件下筛选单核再生菌株，然后将白玉菇单核菌株与灰蟹菇单核菌株配对杂交，接种培养，纯化，即得。

A hybrid breeding method of mushroom

The invention discloses a mushroom extract Xian hybrid breeding method, the specific steps are as follows: (1) the hypsizygusmarmoreus and grey crab mushroom strains were cultured from the corresponding age of mycelium; (2) the protoplast preparation and regeneration: under aseptic condition, step (1) from different age mycelium enzyme solution, obtained protoplast purification, adding protoplast regeneration medium, sealing the culture; (3) after protoplast regeneration and tip mycelium were cultured under sterile conditions to select single nuclear regeneration strains and Monocaryotic strains of white mushroom and grey crab mushroom Monocaryotic strains were cultured, purified paired hybridization. That is.

【技术实现步骤摘要】
一种萃仙菇杂交育种方法
本专利技术涉及一种杂交育种方法，具体涉及一种萃仙菇杂交育种方法。属于食用菌育种

技术介绍
自然界中存在大量可供人类食用的大型真菌，具体地，食用菌一般是指可供食用的蕈菌，其能形成大型的肉质/胶质子实体或菌核类组织并能供人们食用。由于人工栽培的食用菌品种有限，因此已知品种的栽培方法以及新品种的研制一直是食用菌领域的研究热点。真姬菇，又名海鲜菇，质地脆嫩，味道鲜美，营养丰富，具有海蟹味，自20世纪80年代以来，真姬菇已在我国开始了商品化种植，现已成为全国食用菌重要的工厂化产品之一。在栽培生产中其生产周期较长（120-140天），菌体的生长速度较慢、抑制杂菌的能力较差，易染菌，而且易受栽培环境和栽培条件的影响，在生产中受到一定限制。目前栽培的有浅灰色和纯白色两个品系，白色品系又称“白玉菇”，深受市场欢迎，多为工厂化栽培。济南蓬生农业科技有限公司主营真姬菇的工厂化生产，近年通过组织分离等技术创新研发出食用菌新品种——萃仙菇，其菇帽灰色，菇杆呈灰色渐变乳白色。该品种基质利用效率高、有效菇蕾数较多、产量高、平均产量527.3g/袋（带头菇），比原菌白玉菇471.0g/袋（带头菇）增产11.95%以上，成品率提高15.5%；该品种原基形成快，菇蕾均匀密度大，养菌时间缩短5~7天，出菇时间缩短2~3天，培养周期较白玉菇缩短7~10天、最适温度提高2-3℃、降低能耗与生产成本；该品种产品粗纤维含量高，精氨酸含量较高、味道鲜美，口感上佳，营养价值和药用价值极高，具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、清心润肺、降低血糖、抗衰老、抗辐射、增强细胞活性等功能，自上市以来受到了广大消费者的广泛认可。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服现有工厂化栽培常用真姬菇菌种存在的生产周期较长、易染菌、抗逆性差等问题，提供一种萃仙菇杂交育种方法，筛选出具有优良性能的真姬菇新品种（萃仙菇）来替代现有品种。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种萃仙菇杂交育种方法，具体步骤如下：（1）将白玉菇菌株与灰蟹菇菌株分别培养得到对应的适龄菌丝；（2）原生质体的制备与再生：无菌条件下，将步骤（1）所得适龄菌丝分别进行溶壁酶酶解处理，得到原生质体，纯化，加入原生质体再生培养液，封口培养；（3）挑取再生原生质体的尖端菌丝进行培养，并在无菌条件下筛选单核再生菌株，然后将白玉菇单核菌株与灰蟹菇单核菌株配对杂交，接种培养，纯化，即得。优选的，步骤（1）的培养方法为：先接种至试管斜面PDA培养基，25℃恒温培养10天，然后转接到平板PDA培养基，25℃恒温培养5～7天，再转接到250mL三角瓶液体加富培养基中，25℃恒温摇床上震荡培养4天，最后用无菌枪头吸取5mL新鲜幼嫩培养液到另一个250mL三角瓶液体加富培养基中，25℃恒温培养4天。优选的，步骤（2）中，溶壁酶酶解处理的具体方法是：无菌条件下，将适龄菌丝倒入离心管中，离心处理，洗涤；用无菌滤纸吸干菌丝水分，然后取菌丝置于另一离心管中，加入溶壁酶溶液，30℃水浴，脱壁2.5小时。进一步优选的，离心处理是在8000rpm条件下离心15～20分钟。进一步优选的，洗涤是采用无菌水和0.6mol/L甘露醇水溶液各洗涤一次。进一步优选的，溶壁酶溶液的质量体积浓度为2.0%，菌丝与溶壁酶溶液的质量体积比为0.1g：1mL。进一步优选的，脱壁过程中，每隔15分钟轻柔颠倒摇晃，使菌丝与溶壁酶溶液充分接触，镜检菌丝破壁情况。优选的，步骤（2）中，纯化方法是：原生质体离心，除去上清酶液，再次离心，稳渗剂洗涤，第三次离心去除稳渗剂与酶液，采用原生质体再生培养液洗涤，吸除上清液。进一步优选的，离心条件相同，均为800rpm条件下离心15分钟。优选的，步骤（2）中，加入原生质体再生培养液5mL，颠倒数次后混匀，静置1小时，待菌丝沉淀后，取上清液到离心管中，加入原生质体再生培养液5mL，稀释后镜检，当原生质体的含量调整至每个低倍镜（10×）视野下只有1～2个原生质体的浓度时，吸取100μL的原生质体悬浮液涂布于原生质体再生培养基平板中，封口膜封口后，25℃恒温培养8～12天。优选的，步骤（3）的具体方法如下：（31）观察原生质体再生的萌发情况，当出现芒状再生菌落的时候，挑取再生原生质体的尖端菌丝至试管斜面PDA培养基中进行培养；（32）在无菌条件下，吸取5～10μL的乳酸石炭酸棉蓝染色液于载玻片上，挑取步骤（31）中培养好的菌丝置于所述染色液中，盖上盖玻片，染色1分钟，橡胶塞压平，制片在显微镜下镜检，以是否存在锁状联合为单核再生菌株的筛选标准；（33）无菌条件下，将白玉菇单核菌株与灰蟹菇单核菌株配对杂交，挑取其单核菌株菌块接种到试管斜面PDA培养基上，两菌块间间隔距离为1cm，25℃恒温培养；（34）当两菌丝交联在一起时，挑取交联的菌丝于载玻片的乳酸石炭酸棉蓝染色液中，盖上盖玻片，染色1分钟，橡胶塞压平，在显微镜视野下镜检，以是否存在锁状联合为判断标准；若发现有锁状联合的菌株，挑取交联菌丝转接到试管斜面PDA培养基中，25℃恒温培养，即得纯化的杂交菌株；（35）杂交菌株验证：进行拮抗反应实验和出菇试验验证杂交种与亲本菌株的形状差异。本专利技术的有益效果：本专利技术利用原生质体单核化技术，对真姬菇进行杂交选育，选育出具有优良性能的真姬菇新品种——萃仙菇。萃仙菇作为一种食用菌新品种，其性能优化、生物效率和人工栽培产量的提高是当前的研究重点。本专利技术通过杂交育种获得萃仙菇，生长速度上与亲本菌株相比，生长周期73天，比亲本提前7天育成采收，平均菌柄长度8.3~9.1cm，平均菌盖直径1.3~1.8cm，平均单瓶产量53.19~65.31g，平均生物学效率88.7~108.9%，优于亲本菌株，表现出明显的杂种优势，从子实体形态特征上看均表现出两亲本的互补性状，从颜色上看，与亲本白玉菇更为接近；从子实体形态上，与亲本灰蟹菇更为接近。附图说明图1是拮抗实验结果；图2是子实体形态。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。本专利技术涉及的白玉菇菌株与灰蟹菇菌株购自泌阳县真菌研究开发有限公司。本专利技术所需试剂如下：1、PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用。2、液体加富培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母浸膏5g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，维生素B10.1g，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用。3、原生质体再生培养基：马铃薯200g，麦芽糖5g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，甘露醇109.32g，琼脂粉20g，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用。4、原生质体再生培养液：马铃薯200g，麦芽糖5g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，甘露醇109.32g，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用。5、组织栽培瓶培养基：棉籽壳71%，麸皮23%，玉米粉5%，生石灰1%，加水调节含水量至65%，121℃高压蒸汽灭菌3h，冷却备用。6、稳渗剂：0.6mol/L的甘露醇溶液，pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种萃仙菇杂交育种方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）将白玉菇菌株与灰蟹菇菌株分别培养得到对应的适龄菌丝；（2）原生质体的制备与再生：无菌条件下，将步骤（1）所得适龄菌丝分别进行溶壁酶酶解处理，得到原生质体，纯化，加入原生质体再生培养液，封口培养；（3）挑取再生原生质体的尖端菌丝进行培养，并在无菌条件下筛选单核再生菌株，然后将白玉菇单核菌株与灰蟹菇单核菌株配对杂交，接种培养，纯化，即得。

【技术特征摘要】
1.一种萃仙菇杂交育种方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）将白玉菇菌株与灰蟹菇菌株分别培养得到对应的适龄菌丝；（2）原生质体的制备与再生：无菌条件下，将步骤（1）所得适龄菌丝分别进行溶壁酶酶解处理，得到原生质体，纯化，加入原生质体再生培养液，封口培养；（3）挑取再生原生质体的尖端菌丝进行培养，并在无菌条件下筛选单核再生菌株，然后将白玉菇单核菌株与灰蟹菇单核菌株配对杂交，接种培养，纯化，即得。2.根据权利要求1所述的一种萃仙菇杂交育种方法，其特征在于，步骤（1）的培养方法为：先接种至试管斜面PDA培养基，25℃恒温培养10天，然后转接到平板PDA培养基，25℃恒温培养5～7天，再转接到250mL三角瓶液体加富培养基中，25℃恒温摇床上震荡培养4天，最后用无菌枪头吸取5mL新鲜幼嫩培养液到另一个250mL三角瓶液体加富培养基中，25℃恒温培养4天。3.根据权利要求1所述的一种萃仙菇杂交育种方法，其特征在于，步骤（2）中，溶壁酶酶解处理的具体方法是：无菌条件下，将适龄菌丝倒入离心管中，离心处理，洗涤；用无菌滤纸吸干菌丝水分，然后取菌丝置于另一离心管中，加入溶壁酶溶液，30℃水浴，脱壁2.5小时。4.根据权利要求1所述的一种萃仙菇杂交育种方法，其特征在于，步骤（2）中，纯化方法是：原生质体离心，除去上清酶液，再次离心，稳渗剂溶液洗涤，第三次离心去除稳渗剂与酶液，采用原生质体再生培养液洗涤，吸除上清液。5.根据权利要求1所述的一种萃仙菇杂交育种方...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘克东，刘振涛，于秀英，杨晶，闫卫荣，单书凯，
申请(专利权)人：济南蓬生农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37