定量检测肉制品中羊、牛和猪源性的引物、探针和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于TaqMan PCR技术一次性检测羊、牛和猪源性成分的引物、探针、试剂盒及检测方法，正向引物：5'‑AGAAATGGGCTACATT(T/C)TCT‑3'，反向引物：5'‑TTTACTGCTAAATCCTCCTT‑3'，羊探针：5'‑CCCAAGAAAATTTAATACGAAAGCCATT‑3'，牛探针：5'‑CACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATT‑3'，猪探针：5'‑CATAAGAATACCCACCATACGAAAGTTTTTAT‑3'；本发明专利技术的引物、探针及试剂盒的特异性好、灵敏度高，可以实现动物源性的定性和定量检测，并且可以进行羊、牛和猪源性的同时检测。

Quantitative detection of the primers, probes and kits of sheep, cattle and pigs in meat products

The invention discloses a method based on TaqMan PCR technology disposable testing sheep, cattle and pig derived ingredients of the primer, probe and kit and detection method, forward primer: 5'AGAAATGGGCTACATT (T/C) TCT 3', reverse primer: 5'TTTACTGCTAAATCCTCCTT 3', 5'CCCAAGAAAATTTAATACGAAAGCCATT probe: sheep 3', cattle 5'CACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATT probes: 3', 5'CATAAGAATACCCACCATACGAAAGTTTTTAT pig probes: 3'; specific primer, probe and kit of the invention is good, high sensitivity, can realize the animal sources of qualitative and quantitative detection, and can detect the sheep and cattle and swine at the same time.

【技术实现步骤摘要】
定量检测肉制品中羊、牛和猪源性的引物、探针和试剂盒
本专利技术属于食品检测
，尤其涉及动物源性检测领域。
技术介绍
动物源性成分是指动物组织以及蛋和奶，包括肉类及其制品(含动物脏器)等食品或饲料。动物源性检测是指从动物源性食品(肉制品、乳制品等)以及饲料中检测其源性成分的过程。动物肉类、乳制品为人类的生命活动提供了丰富的蛋白质、脂肪和B族维生素等，是人们生活的重要食品来源。但在利益的驱动下在食品加工、流通和餐饮领域中掺假事件时有发生。由于价格差带来的利益诱惑，驱使一些不法商贩、企业在牛、羊、鹿等高价肉制品中掺杂猪、鸭等低价肉原料；用低价肉或非肉成分经香精处理后冒充高价肉；用牛奶冒充羊奶；用非原产地产品冒充原产地产品等；甚至还有一些商家厂家为谋取利益隐瞒或更改说明书。这些掺杂使假的行为不仅严重侵害了消费者利益，有时还会涉及到“民族”问题、“宗教”问题等不良的社会影响，如果问题产品出口到国外更会损害我国食品企业的整体形象而影响出口贸易。动物源性检测正是应对这些问题，除了起到保护消费者合法权利、民族利益、宗教信仰以外还能防止牛海绵状脑病(BSE)、传染性海绵状脑病(TSE)，疯牛病(MCD)以及口蹄疫(FMD)等人畜传染病的传播。作为牛、羊、马产品基地的锡林郭勒盟迫切需要研发具有自主知识产权的动物源性检测试剂盒。近年来，肉、奶等食品中掺假造假的投诉事件不断上升，疯牛病的传播风险也在不断加大，作为保障食品安全、维护消费者利益的重要技术手段，食品和饲料中动物源性成分的定性或定量检测技术已成为国内外的研究热点。研发出适用于各种样品的多通道、高效、特异性强、快速的检测方法是亟待解决的问题。本试剂盒的研发是基于TaqManPCR技术的多通道动物源性检测方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种高效且特异性强的基于TaqManPCR技术的一次性检测羊、牛、猪源性成分的引物序列和探针，解决羊、牛、猪源性成分定性和定量检测问题。本专利技术的技术方案为：基于TaqManPCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪肉源成分的引物和探针，引物和探针序列如下：正向引物：5'-AGAAATGGGCTACATT(T/C)TCT-3'，反向引物：5'-TTTACTGCTAAATCCTCCTT-3'，羊探针：5'-CCCAAGAAAATTTAATACGAAAGCCATT-3'，牛探针：5'-CACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATT-3'，猪探针：5'-CATAAGAATACCCACCATACGAAAGTTTTTAT-3'；羊、牛和猪探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。基于TaqManPCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪肉源成分的方法，步骤如下：(1)利用CTAB法或者DNA提取试剂盒提取肉制品的DNA；(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100ng/μL；(3)利用本专利技术的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量PCR扩增，利用羊、牛和猪阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；(4)Real-timePCR反应结束后，设置Threshold为自动，读取羊、牛和猪相应探针的Ct值以及阳性对照、阴性对照和空白对照的Ct；只有当阳性对照Ct≤35，阴性对照和空白对照Ct为0时才可以进行相应探针源性结果的判定；当相应探针的Ct≤35，结果判定为具有相应源性，同时有多个探针的Ct≤35，结果判定为具有相应两源性或三源性；(5)利用羊、牛和猪阳性标准品做DNA定量的标准曲线；(6)通过将检测肉制品的相应源性的Ct值带入标准曲线中的公式可以得到肉制品中相应源性的定量检测结果。进一步地，Real-timePCR扩增参数为：预变性温度94℃，30s，变性温度94℃，5s，退火延伸温度60℃，31s，40循环。进一步地，Real-timePCR反应体系为：ProbeqPCRmix10μL，正向引物、反向引物、羊探针、牛探针和猪探针各1μL，DNA1μL，灭菌的去离子水4μL，总体积20μL。含有权利要求1所述的引物和探针的试剂盒。该试剂盒包含：ProbeqPCRmix、正向引物、反向引物、羊探针、牛探针、猪探针、羊阳性标准品、牛阳性标准品、猪阳性标准品。本专利技术通过比对羊、牛、猪、马、骆驼、驴、鸡、鸭、兔、鹅等10种动物的线粒体基因组，每种动物选取10个品种或品系的线粒体基因组序列。通过生物信息软件比对上述100条序列，筛选出羊、牛、猪保守和特异的序列，利用引物设计软件进行引物和探针的设计。设计的创新性在于需要在100-150bp的序列上筛选出两端保守和中间特异的序列，两端保守的位置设计引物，中间特异的位置设计探针。保守的引物和特异的探针可以有效的减少引物之间的错配以及多个PCR反应对反应资源的竞争，可以保证多重实时荧光定量PCR反应的进行。多重实时荧光定量PCR反应是多源性成分检测的基础。引物和探针的退火温度控制在55-60℃和65-70℃，并且没有影响退火效率的二级结构，而且要保证引物和探针在线粒体基因上具有高度的特异性，上述设计保证引物和探针可以用于后续的定性和定量检测。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的引物、探针及试剂盒的特异性好、灵敏度高，可以实现动物源性的定性和定量检测，并且可以进行羊、牛和猪源性的同时检测。附图说明图1利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性的实时荧光定量PCR的检测，说明待测样品有羊源性。图2利用HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性的实时荧光定量PCR的检测，说明待测样品有牛源性。图3利用ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明待测样品有猪源性。图4利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有羊单源性检测能力以及待测样品只有羊源性。图5利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有牛单源性检测能力以及待测样品只有牛源性。图6利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有猪单源性检测能力以及待测样品只有猪源性。图7利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有羊和牛双源性检测能力以及待测样品有羊和牛源性。图8利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰探针标记猪源性的实时荧光定量PCR的检测，说明混合探针具有羊和猪双源性检测能力以及待测样品有羊和猪源性。图9利用FAM和TAMRA修饰探针标记羊源性、HEX和TAMRA修饰探针标记牛源性及ROX和BHQ2修饰本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于TaqMan PCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪源性成分的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：正向引物：5'‑AGAAATGGGCTACATT(T/C)TCT‑3'，反向引物：5'‑TTTACTGCTAAATCCTCCTT‑3'，羊探针：5'‑CCCAAGAAAATTTAATACGAAAGCCATT‑3'，牛探针：5'‑CACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATT‑3'，猪探针：5'‑CATAAGAATACCCACCATACGAAAGTTTTTAT‑3'；羊探针、牛探针和猪探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。

【技术特征摘要】
1.基于TaqManPCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪源性成分的引物和探针，其特征在于，引物和探针序列如下：正向引物：5'-AGAAATGGGCTACATT(T/C)TCT-3'，反向引物：5'-TTTACTGCTAAATCCTCCTT-3'，羊探针：5'-CCCAAGAAAATTTAATACGAAAGCCATT-3'，牛探针：5'-CACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATT-3'，猪探针：5'-CATAAGAATACCCACCATACGAAAGTTTTTAT-3'；羊探针、牛探针和猪探针序列的5'端修饰有报告基团，3'端修饰有淬灭基团，其中所述报告基团为FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述淬灭基团为TAMRA、BHQ1或BHQ2中任意一种。2.基于TaqManPCR技术一次性定性和定量检测羊、牛和猪源性成分的方法，其特征在于，步骤如下：(1)利用CTAB法或者DNA提取试剂盒提取肉制品的DNA；(2)检测DNA的浓度和质量，并将浓度稀释至100ng/μL；(3)利用权利要求1所述的引物和探针对稀释DNA进行多重荧光定量PCR扩增，利用羊、牛和猪阳性标准品做阳性对照，利用灭菌的去离子水做阴性对照，利用DNA提取的空白对照做提取方法的对照组；(4)Real-timePCR反应结束后，设置Thres...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭梁，郭元晟，海小，雅梅，钱俊平，孙建萍，徐伟良，廖成松，冯伟，罗建兴，刘国强，
申请(专利权)人：锡林郭勒职业学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15