促骨成形蛋白表达的新型抗骨质疏松药物筛选模型制造技术

本发明专利技术涉及一种促骨成形蛋白表达的新型抗骨质疏松药物筛选模型，该模型采用了微生物学方法进行初筛和细胞学方法进行复筛相结合的步骤，初筛使用发酵液或其它天然产物，以筛选胆固醇生物合成途径中ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶抑制剂为目的，复筛使用发酵液或天然产物的初提品，以骨成形蛋白ｂｍｐ－２基因启动子为靶点，将ｂｍｐ－２表达效应作为鉴定指标，所说的筛选模型具有较高的灵敏性，操作简便，适于大规模高通量筛选，可为抗骨质疏松药物的研制提供有前景的候选化合物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在微生物和哺乳动物细胞水平上建立的一种新型抗骨质疏松药物筛选模型，具体地说，涉及胆固醇合成代谢和骨成形蛋白的表达调节的新型抗骨质疏松药物筛选模型。在骨的形成过程中，以清除受损碎片，形成骨洞为主要作用的破骨细胞(osteoclasts，ocs)和以沉积钙质，填充骨洞为主要作用的成骨细胞(osteoblasts，obs)相互协调，使骨质的形成与溶解处于一种动态平衡，维持骨质的不断更新。当此动态平衡被打破，骨溶解超过骨形成时，即导致骨质疏松。因此，任何能够直接或间接作用于成骨细胞和/或破骨细胞，有助于保持其动态平衡的物质，均可能有防治骨质疏松的作用。以往的研究与治疗方案大多针对破骨细胞以控制骨质的损失。然而，更有效的骨质疏松治疗应是通过改善骨质的形成代谢，增强成骨细胞的作用，最终达到恢复患者正常骨水平的目的。骨成形蛋白(BMPs)是转化生长因子(TGF-β)超家族中的一类蛋白，己被鉴定的有BMP1-15，因为人和鼠的BMP-2氨基酸序列具有较高的同源性，所以本专利技术将小鼠BMP-2作为研究对象。BMP-2是由396个氨基酸组成的糖基化多肽。BMPs沉积于骨基质，吸引骨髓中的干细胞并与其表面的受体相结合，该受体为I型蛋白和II型蛋白形成的二聚体复合物，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。通过自我磷酸化而开始信号传导，激活胞质蛋白，刺激干细胞分化成为成骨细胞，引发软骨内和膜内两种骨形成过程。在骨形成过程中，成骨细胞在各种细胞因子的调控下程序性表达生长调节因子，BMP-2启动并维持这一级联反应，提高了矿化过程中BMP-3、BMP-4以及骨细胞分化标志—碱性磷酸酶、I型胶原、骨钙素等的基因表达。因此，BMP是以一种旁分泌的形式在骨重建过程中协同刺激骨细胞分化，促进新骨的形成及骨的层次化。进一步的研究还表明，不表达bmp-2的成骨细胞不具备分化能力，但若对这种细胞加入外源性的重组或将其cDNA导入这种细胞后，可促进它的分化。实验结果提示，bmp-2基因的表达对于成骨细胞是必不可少的。到目前为止，以BMP为靶点的抗骨质疏松药物筛选模型国内尚未见报道。在国外，1999年Mundy等曾经报道利用转基因鼠成骨细胞筛选促成骨细胞分化的活性物质，并证明lovastatin，simvastatin具有促成骨细胞分化作用(Science 2861946-1949，1999)。statin类药物原为β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，临床上用于降低血脂。这一发现引发了对statin类药物抗骨质疏松作用机制的探讨。Mundy等人进行了Lovastatin，Simvastatin对骨形成影响的可能通路的研究，推测statins通过以下途径促BMP-2表达，进而影响骨质形成Statin类抑制胆固醇合成通路中焦磷酸法尼酯(Farnesyl Pyrophosphate，FPP)的合成从而减少Ras蛋白的脂化修饰影响Ras蛋白功能，Ras蛋白与胞外调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)作用上调BMP表达量。Statins→FPP→Ras→Ras-ERK.signals↑→BMP↑Mundy等人的研究为建立更有效而简便的筛选抗骨质疏松药物方法提供了新思路，如果能够找到更有效地抑制HMG-CoA还原酶的药物就意味着找到了更有效的促骨形成药物。此外，已有的statins作为抗高胆固醇药物，对肝细胞的靶向作用强于骨细胞，因此，有必要通过大量筛选来寻找对骨组织有特异性抑制作用的药物。本专利技术将胆固醇合成抑制剂的微生物学筛选方法作为初筛模型，所说的方法基于以下原理β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶是胆固醇合成中的一个限速酶，该酶催化HMG-CoA还原生成甲羟戊酸(MVA)，当该酶被抑制时，胆固醇的生物合成被阻断，HMG-CoA还原酶抑制剂(如statins)由于和HMG-CoA结构极为相似因而能竞争性抑制HMG-CoA还原酶，从而抑制肝细胞胆固醇合成(附图说明图1)。通过研究胆固醇生物合成限速酶-HMG-CoA还原酶抑制剂statins的抗菌活性，发现Lovastatin对赭色掷孢酵母SO4(中国科学院微生物所提供)具有很强的抗菌作用，而这种抑制作用被胆固醇合成的中间产物MVA所抵消，因此，可以将对赭色掷孢酵母SO4的抗菌作用及MVA抵消作用阳性结果作为指标，筛选天然产物。本专利技术系以statins对于bmp-2表达上调作用作为复筛模型。由于Statins对于BMP-2表达上调的作用机制与胆固醇合成代谢紧密相关，在成骨细胞内这一上调效应同样可以被MVA所阻断，说明它们也是通过对HMG-CoA还原酶竞争抑制从而影响下游代谢产物，最终通过对转录因子的作用而产生促BMP-2表达效应。本专利技术从人体内胆固醇代谢机制和细胞信号传导通路的作用机制出发，将快捷灵敏的微生物测试法和基于细胞水平上的准确性较高的促BMP-2表达上调检测方法相结合，克服了单一细胞模型不宜筛选来源广泛、成分复杂的天然产物库的局限性，更加适合现代高通量药物筛选的需要。专利技术目的基于BMPs作用机理的最新研究，本专利技术以bmp-2启动子为作用靶点，结合基因工程、细胞工程等技术，建立更简便、更准确、易于操作的新模型，从大量天然产物中快捷地筛选能促进成骨细胞分化的先导化合物，以获得组织特异性更强的改善体内骨代谢平衡的治疗骨质疏松的新型药物。
技术实现思路
初筛以Lovastatin的抗菌作用及Lovastatin的抗菌作用被MVA抵消(称为双阳性)为依据，采用平板纸片法测量样品对敏感菌株SO4的抑制活性及特异性抑制作用。初筛模型研究包括3个测试部分一、测定Lovastatin对敏感菌株SO4的最低抑制浓度；二、测定MVA的最低抵消浓度；三、初筛模型的应用研究一、SO4对Lovastatin的敏感性反映了模型的敏感性，测定浓度分别为100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1μg/ml的Lovastatin对SO4的抗菌作用，结果表明浓度为2.5μg/ml的Lovastatin就能抑制SO4的生长，浓度为5μg/ml时，能明显地抑制SO4的生长。说明SO4对Lovastatin具有很高的敏感性，以SO4为检验菌株的该筛选模型具有较高的灵敏度。二、用平板纸片法，测定不同浓度的MVA对浓度为50μg/mL，20μg/mL的Lovastatin的抑制SO4生长的抵消作用，结果当MVA浓度为3mg/片时呈现抵消作用，5mg/片时抵消作用非常明显。考虑到易于观察和模型的稳定性等因素，因而在实际进行筛选时使用8mg/片的MVA(图2)。三、对微生物发酵液或其它天然产物进行筛选得到双阳性菌株，在对这些菌株产生的活性物质进行初步分离纯化后进行复筛。复筛模型中采用了80年代中后期发展起来的较氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告系统灵敏度更高的双荧光素酶(luciferase，LUC)报告系统，将小鼠bmp-2启动子与不带启动子的萤火虫荧光素酶报告基因载体相连构建pYJ2，同时转染海三色堇荧光素酶报告质粒pRL-TK作为阳性对照，检测待测物作用后细胞裂解物中除去本底后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促骨成形蛋白表达的抗骨质疏松药物筛选模型，其特征在于所说的筛选模型是先采用微生物学方法进行初筛，然后采用细胞学方法进行复筛。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张月琴，杨隽，尚广东，司书毅，苏学惠，黄明玉，魏玉珍，关艳，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]