一种利用分子检索表对昆虫进行分类鉴定的方法技术

一种利用分子检索表对昆虫进行分类鉴定的方法，其特征在于：所述方法包括将用于确定昆虫分类地位的通用探针和特异探针固定在固相载体上制备成基因芯片，再将昆虫ＤＮＡ与该基因芯片杂交，根据杂交结果查对预先设定的分子检索表从而确定昆虫的分类地位；　　　　所述通用探针包括科通用探针、属通用探针、亚属通用探针中的至少一种；　　　　所述特异探针包括复合种／近缘种特异探针、种特异探针、亚种特异探针中的至少一种；　　　　所述分子检索表根据杂交结果中各探针是否为阳性按照二分法将杂交结果进行分类，并列出杂交结果与昆虫种类的对应关系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种昆虫分类鉴定方法，特别是涉及。
技术介绍
昆虫是世界上已知种类最多的生物类群，数量达到100多万种。种类繁多的昆虫与其它人类认识的生物类群一样都是通过生物分类系统来认知的。目前，公认的生物分类系统主要包括7个分类阶元界Kingdom、门Phylum、纲Class、目Order、科Family、属Genus、种Species。从界到种，分类阶元依次变小，种是分类的基本单元。当然在各个基本分类阶元之间还会细分一些其它分类位如总纲Superclass、总科Superfamily、亚科Subfamily、亚属Subgenus、亚种Subspecies等。如桔小实蝇Bactrocera(Bactrocera)dorslais属双翅目Diptera、实蝇科Tephritidae、寡鬃实蝇亚科Dacinae、寡鬃实蝇族Dacini、果实蝇属Bactrocera、果实蝇亚属Bactrocera。昆虫物种的学名主要由属名和种名两部分组成，如下所示 昆虫(狭义六足动物)属动物界Animal、节肢动物门Arthropoda、六足总纲Hexapoda、昆虫纲Insecta。昆虫的识别和鉴定通常是通过一种称为检索表Key来实现的，检索表编制原理简单，就是严格的二分法即A类和非A类。传统的检索表一般利用昆虫形态上的特征来分类，将昆虫分成两类时，所选用的形态特征绝不能存在着“似是而非”和中间状态。编制检索表是反复使用二分法的过程。 根据使用目的的不同，昆虫检索表会分至不同的分类阶元。检索表将某一类群昆虫依照某些稳定且易于观察和鉴别的形态特征进行一系列的二分，最终指向目、科、属、种...，由于检索表以稳定而显著的特征进行分类，因此，使用检索表鉴定生物物种一般能够得到比较准确的结果。 但是，采用这种传统形态学鉴定方法需要扎实的昆虫分类学基础知识和丰富的分类鉴定经验，而且大部分昆虫类群的分类鉴定主要以成虫的形态特征为依据，而对卵、幼虫和蛹通常无法进行种类鉴定，存在很大的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了解决以上问题，提供一种能够从分子水平利用分子检索表对昆虫进行分类鉴定的方法。 为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案本专利技术公开了，所述方法包括将用于确定昆虫分类地位的通用探针和特异探针固定在固相载体上制备成生物芯片，再将昆虫DNA与该生物芯片杂交，根据杂交结果查对预先设定的分子检索表从而确定昆虫的分类地位；所述通用探针包括科通用探针、属通用探针、亚属通用探针中的至少一种；所述特异探针包括复合种/近缘种特异探针、种特异探针、亚种特异探针中的至少一种；所述分子检索表根据杂交结果中各探针是否为阳性按照二分法将杂交结果进行分类，并列出了杂交结果与昆虫种类的对应关系。 由于采用了以上的方案，使本专利技术具备的有益效果在于本专利技术从分子水平实现了对昆虫的分类鉴定，解决了传统形态学鉴定必须具备扎实的昆虫分类学基础知识和丰富的分类鉴定经验的问题，也结局了传统昆虫种类鉴定必须以成虫形态特征为主要鉴定依据，对卵、幼虫和蛹无法进行种类鉴定的问题；实现了非昆虫分类科技工作者可以准确完成昆虫种类鉴定的突破，同时实现了对卵、幼虫和蛹也可以进行准确种类鉴定。同时，由于采用分子鉴定表，避免了鉴定过程中似是而非的判断，可以实现鉴定结果的计算机自动输出，从而大大降低了人为鉴定的主观性并提高了自动化的程度，为昆虫分类鉴定的标准化奠定了基础，该项技术的推广应用前景将十分广阔。具体实施方式近年来，在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)上公开发表的昆虫基因序列迅猛增长。昆虫分子信息学的兴起，为昆虫分子检索表提供了大量基因信息数据，借助这些公共数据和有关生物技术软件，可将某一类群的昆虫序列全部收集起来，并按基因类别或物种进行比较分析，找出一个或多个合适的昆虫分子标记基因或基因片段，用于设计科、属的通用探针和种(亚种)的特异探针，最终以常规PCR、实时荧光PCR或基因芯片技术来实现昆虫物种的鉴定及近似种类的区分。 基因芯片技术是近10多年来新兴的一门技术，主要应用到生物科学众多的领域之中，包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。基因芯片技术以其可高通量、高灵敏度和高特异性地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。但基因芯片应用于昆虫物种分类，特别是应用于昆虫卵、幼虫、蛹和成虫的快速种类鉴定目前尚未见报道。 本专利技术提出一种昆虫分子鉴定的方法。通过现代分子生物学技术(如昆虫基因组DNA提取方法、PCR技术、分子杂交、DNA(探针、引物)合成、氨基修饰和荧光标记技术等)为手段，借助芯片点样仪、杂交仪等先进仪器设备，运用基因芯片技术，首先将能区分昆虫某一类群的一组DNA探针以点阵的形式固化在一张固相芯片载体上，再将来自待分类昆虫的带有荧光标记物的PCR目标产物加在芯片上，使PCR产物与芯片上的通用和特异探针杂交，通过检测杂交信号，根据固定在芯片上的各探针，一次性准确地确定昆虫所属的分类地位(科、属、种甚至是亚种)。从而实现昆虫分子快速种类鉴定，其杂交扫描结果可通过人工检查来判定昆虫的分类地位，甚至可以通过电脑程序直接输出鉴定结果，从而实现昆虫种类自动化鉴定。 本专利技术的方法具体包括昆虫基因组DNA提取昆虫的卵、幼虫(若虫)、蛹和成虫(或部分个体)作为实验材料，采用动物/昆虫基因组DNA提取方法获得昆虫基因组DNA，作为下游实验的模板。 昆虫分子标记基因和目标片段的筛选收集昆虫某一类群相近种类的基因序列信息，选择合适的分子标记基因和基因片段，设计通用引物，获得芯片杂交所必需的目标片段。 通用探针和特异探针的筛选借助生物计算机软件，设计和筛选用于确定昆虫分类地位的通用探针(科、属、亚属、复合种/近缘种)和特异探针(种或亚种)。 基因芯片的制备利用点样仪将各类探针固化在固相的芯片载体表面上(如醛基化玻璃片)，经过水合、固定和洗片，获得带探针矩阵的芯片。探针除通用探针以及特异探针外，通常包括定位探针、阳性对照探针、阴性对照探针及空白对照。除定位探针外，其他各类探针在探针矩阵上通常有3个重复，以确保实验结果的重复性和稳定性。 PCR产物与探针杂交将通用引物PCR扩增所得到的一种或多种带荧光标记物的PCR产物，加上适量的杂交缓冲液，混合，95℃变性加入有探针的固相芯片载体，在一定的温度下(40℃～60℃)杂交1～3h或以上，洗片洗去多余的杂交液。 杂交信号检测和结果确认将经过杂交反应的固相芯片载体用芯片扫描仪进行信号检测，通过检测一条或一组通用探针或特异探针的杂交信号或信号强弱来确定昆虫的分类地位及其种类。 所述的通用引物，为一段寡核苷酸序列，引物可以是用Cy3或Cy5荧光标记，也可以是不作任何标记。其作用是在PCR扩增中能扩增昆虫某一类群(如同科和同属)所有种类同一分子标记基因(即通用探针或特异探针所在位置)的全部或部分片段，获得芯片杂交所需的带荧光标记物的目标DNA模板。如通用引物不作荧光标记，则在PCR反应体系中掺入带Cy3或Cy5标记的荧光的dCTP。 所述的通用探针为一段带有基因修饰的探针，其5′端或3′端氨基修饰；其作用是能适用于昆虫某一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用分子检索表对昆虫进行分类鉴定的方法，其特征在于所述方法包括将用于确定昆虫分类地位的通用探针和特异探针固定在固相载体上制备成基因芯片，再将昆虫DNA与该基因芯片杂交，根据杂交结果查对预先设定的分子检索表从而确定昆虫的分类地位；所述通用探针包括科通用探针、属通用探针、亚属通用探针中的至少一种；所述特异探针包括复合种/近缘种特异探针、种特异探针、亚种特异探针中的至少一种；所述分子检索表根据杂交结果中各探针是否为阳性按照二分法将杂交结果进行分类，并列出杂交结果与昆虫种类的对应关系。2.根据权利要求1所述的一种利用分子检索表对昆虫进行分类鉴定的方法，其特征在于所述昆虫DNA是指以昆虫基因组DNA为模板，利用通用引物经PCR扩增得到的靶基因DNA片段，所述通用引物是指能扩增出昆虫基因组DNA中通用探针或特异探...

【专利技术属性】
技术研发人员：余道坚，徐浪，仲建忠，康林，陈志粦，焦懿，李建光，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：