黄瓜白粉病抗性主效ＱＴＬ紧密连锁分子标记方法和应用方法技术

本发明专利技术涉及的是一种生物技术领域的与黄瓜白粉病抗性主效ＱＴＬ紧密连锁的分子标记方法。包括以下步骤：黄瓜白粉病感病品种Ｓ９４（♀）和黄瓜白粉病抗病品种Ｓ０６（♂）杂交，得到杂种Ｆ↓［１］；通过子代单粒传方法获得Ｆ↓［７］代的重组自交系；分离每个重组自交系单株黄瓜叶片的ＤＮＡ，进行ＰＣＲ扩增；对分子标记分析资料构建黄瓜遗传连锁图；用于统计分析和ＱＴＬ定位；确定与抗源Ｓ０６白粉病抗性主效ＱＴＬ连锁的分子标记Ｆ、ＣＳＥＰＧＮ１１、ｅ２３ｍ１８ｆ和ＭＥ１１ＥＭ９ｃ。本发明专利技术鉴定结果与田间抗病吻合率由９４％提高到１００％。利用与抗源Ｓ０６抗白粉病主效ＱＴＬ紧密连锁的分子标记，可以不受环境条件的影响，对该特定抗源的后代及其衍生品种（系）在早代苗期进行筛选，节约成本，提高育种和选择效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物
的分子标记方法和应用方法，尤其是一种黄瓜 白粉病抗性主效QTL紧密连锁分子标记方法和应用方法。
技术介绍
黄瓜白粉病(PM， powdery mildew)由专性活体寄生的白粉菌引起，在温室和大 田都普遍发生的叶部病害；病原白粉菌主要包括瓜单囊壳(Podosphaeraxanthii)和二 抱白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)两禾中；中国以瓜单囊壳(P. xanthii)危害较 为普遍。白粉病病原寄主广泛，成熟孢子可随空气气流传播；干燥、凉爽季节易发生，白 粉病菌可以感染黄瓜植株叶片、茎和花，在开花期感染白粉病可减少产量20 40%。喷 洒杀菌剂和种植抗病品种是防御此病的主要方法。但长期使用杀菌剂会危害环境安全， 且易引起病菌小种变异产生拮抗作用。推广种植抗病品种是安全、环保和高效的控制策 略。大量前人工作(毛爱军，植物保护科学，2005， V21 :302 321 ; ;Morishita M， J即an Agricultural ResearchQuarterly (日本农业科学季干lj ) ， 2003， 37 (1) :7 14 ;Sakata Y， Theor ApplGenet (应用遗传理论)，2006， 112 :243 250 ;张桂华，园艺学报，2004， 31 (2): 189 192)已表明，黄瓜白粉病的抗性遗传机理复杂；常规育种实践中，对于抗白粉病材料 的选择是十分困难的一方面选育周期长，需要经历杂交和回交复杂的选择程序，另一方面白粉病的发生受到很多因素的综合影响，例如温度、湿度和病菌小种等，鉴定抗性材料的过程不容易控制。这些都导致黄瓜白粉病育种进展缓慢的重要原因。 近几年发展起来的分子标记辅助育种技术，有效地解决了着这一问题，通过构建 重要抗源的遗传图谱和数量性状位点(Quantitative Tratit Loci，QTL)分析，可以找到与 黄瓜白粉病抗性主效QTL紧密连锁(或共分离)的分子标记。使用与某一特定抗源抗白粉 病主效QTL紧密连锁的分子标记，可以对该特定抗源的后代及其衍生品种(系)在苗期进行早代筛选，淘汰不抗病的植株，节约生产成本，提高育种和选择效率(张桂华，园艺学报， 2004,31(2) :189 192) ; ，。 JohanD， TRENDS in Plant Science (植物科学趋势)，2003， Vol.8 No.7;Sakata Y， Theor A卯l Genet (应用遗传理论)，2006， 112 :243 250 ;)。 经对现有技术文献的检索发现，为"鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列及 其鉴定方法"，公开号CN1482132。该专利技术公开了一种鉴定黄瓜白粉病抗性的引物序列 及其鉴定方法，弓I物序列由上游引物5' -CAG TAA ATG AAAGAA AAG AAG-3'，下游引物 5' -ATA CAT AGC CAT ACA AAA AT_3'组成，使用该引物序列的鉴定黄瓜白粉病抗性的方 法，包括如下步骤(l)提取黄瓜基因组的DNA ;(2)进行PCR扩增；(3)PCR扩增产物的凝胶 电泳分析；(4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带的相对位置，鉴定黄瓜白粉病的抗性。但是 该专利技术是代表单基因控制的白粉病抗性基因作用形式，鉴定结果与田间抗病吻合率还 不高。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种黄瓜白粉病抗性主效QTL紧密连 锁的分子标记方法和应用方法。本专利技术是一种多基因控制的白粉病抗性的技术，比背景技 术在鉴定结果与田间抗病吻合率明显提高，不受环境条件的影响，节约了成本，提高了育种 和选择效率。 本专利技术是通过以下技术方案实现的 本专利技术所涉及的黄瓜白粉病抗性主效QTL紧密连锁分子标记的方法，包括以下步 骤 ①黄瓜白粉病感病品种S94(早)和黄瓜白粉病抗病品种S06( $ )杂交，得到杂 种^ ; ②由杂种巳自花授粉获得子代，通过子代单粒传(SSD)方法获得&代的重组自交 系； ③分离每个重组自交系单株黄瓜叶片的DNA，进行PCR扩增，扩增产物电泳分离 后，获得分子标记资料； ⑤接种白粉病病原菌，接种12d后开始调查发病情况，以第l片真叶感病面积10X 为梯度，病情级别划定为0-10级(0 :植株没有感病症状，10级植株真叶叶片布满了白粉 菌丝)，根据病情分级结果，计算出每个家系的病情指数(DI)，家系三次重复的DI的平均值 用于统计分析和QTL定位，为遗传分析的需要，划定抗病(DI《20)，感病(DI > 20); ⑥将重组自交系每个家系的白粉病抗性与黄瓜遗传连锁图中的分子标记进行连 锁和QTL分析，以2. 5为LOD阈值，大于2. 5说明存在一个QTL位点，确定与抗源S06白粉 病抗性主效QTL连锁的分子标记F、 CSEPGNll、 e23ml8f和MEllEM9c。 步骤③中所述的分离每个重组自交系单株黄瓜叶片的DNA，采用引物 TTAACTACTTCGGACGGGCATAG禾口 AGGTGTTCAGCAAACATAGGGTG ;GGAAGTTTGGCTTTGGGAT禾口 TGGAGTACACAGTGGGGGAA ;GACTGCGTACCAATTCT和GATGAGTCTAGAACGGCT ;TGAGTCCAAACCGGTCT 和GACTGCGTACGAATTGAT ;进行PCR扩增，扩增产物在1. 5%琼脂糖凝胶(100ml TAE溶液中 含有1. 5克琼脂糖)和6%聚丙烯酰胺凝胶(100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5. 7克丙 烯酰胺和0. 3克甲叉双丙烯酰胺)上电泳分离后，分别获得分子标记F、CSEPGNll、e23ml8f 禾口 MEllEM9c。 本专利技术所涉及的应用黄瓜白粉病抗性主效QTL紧密连锁分子标记的方法，将分子 标记F、 CSEPGNll、 e23ml8f和MEllEM9c用于黄瓜品种或品系的基因型检测，以判断该品种 或品系是否具有白粉病抗性，包括以下步骤 a)以S06及其衍生品种或品系为父本或母本与其他黄瓜杂交并繁衍至FM戈以上； b)对通过步骤a)获得的黄瓜单个植株，分离叶片DNA，检测分离的DNA中是否存 在与白粉病主效QTL相连锁的分子标记；如有3个以上分子标记同时出现，预测黄瓜对于白 粉病达到抗病水平。 所述的S06及其衍生品种或品系，是指以S06为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采用组织培养、或采用花药培养、或用别的物理或化学方法杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的黄瓜品种或品系。将F、CSEPGNll、e23ml8f和MEllEM9c分子标记用于所述的S06及其衍生品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有白粉病抗性。 本专利技术能克服常规育种中黄瓜白粉病抗性鉴定易受环境影响，在苗期就可通过检 测分子标记对黄瓜植株的白粉病抗性进行预测和筛选，淘汰感病植株，减少在常规育种中 的科研工作者的人力和设备物力的浪费，显著加快育种进程，从而提高育种效率。本专利技术对 抗病品种S06(早)和感病品种($ )杂交获得的重组自交系的每个家系的基因型和每个家 系的白粉病抗性表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄瓜白粉病抗性主效ＱＴＬ紧密连锁分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：①黄瓜白粉病感病品种Ｓ９４（♀）和黄瓜白粉病抗病品种Ｓ０６（♂）杂交，得到杂种Ｆ↓［１］；②由杂种Ｆ↓［１］自花授粉获得子代，通过子代单粒传方法获得Ｆ↓［７］代的重组自交系；③分离每个重组自交系单株黄瓜叶片的ＤＮＡ，进行ＰＣＲ扩增；④基于遗传连锁交换定律，对分子标记分析资料构建黄瓜遗传连锁图；⑤接种白粉病病原菌，接种１２ｄ后开始调查发病情况，用于统计分析和ＱＴＬ定位；⑥将重组自交系每个家系的白粉病抗性与黄瓜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和ＱＴＬ分析，以２．５为ＬＯＤ阈值，大于２．５说明存在一个ＱＴＬ位点，确定与抗源Ｓ０６白粉病抗性主效ＱＴＬ连锁的分子标记Ｆ、ＣＳＥＰＧＮ１１、ｅ２３ｍ１８ｆ和ＭＥ１１ＥＭ９ｃ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙洲，蔡润，潘俊松，何欢乐，姚丹青，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]