利用硫代寡核苷酸探针的ＤＮＡ测序方法技术

利用硫代寡核苷酸探针的ＤＮＡ测序方法进一步降低ＤＮＡ的测序成本，提高每一个序列的测序长度，并缩短每个碱基的阅读时间。通过一种含硫代核苷的测序引物，采用杂交－酶连接－酶切割的高通量测序技术，为ＤＮＡ序列分析提供一种新方法，建立快速、准确、和低成本的高通量ＤＮＡ序列测定技术。本发明专利技术的最大优点是实现了ＤＮＡ序列测定的标记杂交序列的简易合成以及方便将标记物切除，由于杂交的高通量引物是通过非常成熟的固相ＤＮＡ方法合成并纯化得到，因此该方法没有错误延伸的累积效应，能够维持ＤＮＡ模板和测序引物的量，序列的测定正确可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术中DNA测序领域，特别涉及一种利用硫代寡核苷酸探针 的DNA测序方法。
技术介绍
现有技术人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，对当 代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响。人们能够从基因水平上认识生命 现象的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用。就基因序 列分析而言，后基因组时代的重点已由单个物种的全基因組序列测定转移到了对 某一物种在基因组DNA序列层次上个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在基 础研究方面，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找 疾病的易感基因突变位点，通过对于某一特定疾病的大量基因组样本中突变基因 型的大规模鉴定和检测，可以获得与该疾病相关基因型的信息。目前，在寻找新 的功能基因和疾病相关的突变位点方面，人们仍然主要使用常规的Sanger DNA测 序法。这一方法存在通量低和成本高的问题。第一个人类基因组序列测定的费用 大约为10亿美元，但是尽管目前这一费用已经降低到大约2千万美元以下，功能 基因组的研究进展仍然受限于DNA测序技术。为此，美国Venter基金会在2003年 提出了 1000美元人类全基因组测序的研究目标。2004年初，美国国立卫生院投入 巨资支持DNA测序新技术的研究。他们的目标是在近年内发展10万美元的人类全 基因组DNA测序技术，并最终减低为l千美元。美国国立卫生研究院人类基因组 研究中心主任Collins教授指出大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科 学和医学的研究，甚至会带来革命性的变化。目前国际上要完成一个哺乳动物全 基因组的测序仍需要上千万美元。以当前最为先进的ABI Prism 3730 DNA测序 仪为例，完成人类基因组中30亿碱基的测序，需要150台ABI Prism 3730 DNA测 序仪运转一年，其测序成本达到二千四百万美元。现在以Sanger DNA测序法为基 础的，在发展高密度的毛细管阵列，以提高测序的并行性，进而提高DNA的测序 速度这一研究思路在提高DNA测序速度和降低成本方面的改进空间也十分有限。 目前，国际学术界已经清醒地认识到发展快速低成本的人类个体基因组再测序技术的重要性。美国国立卫生院NIH的近期目标是计划在五年内将DNA测序的成本 下降100倍以上，最终在10年内使得测序成本降至1000美元。如何实现个体全基 因组DNA序列的快速有效低成本测定，已是当今国际基因组科学及其应用所面临 的重要挑战之一，也是我国生命科学和医学发展面临的又一次大的机遇。国家科 技部在2006年启动的"十一五"863"生物芯片"重点项目中对低成本快速人类全基因 组的测序技术和相关仪器的研究进行了重点支持。该项目提出了 一万人民币全基 因组测序的目标。在未来的5年中发展出相应的DNA测序模版芯片、试剂和相关 的DNA测序仪，并争取实现产业化。新一代DNA测序技术可以分成三大类。即 杂交测序4支术(sequenceing by hybridization ， SBH)、 合成'测序(sequenceing by synthesis, SBS)技术，和DNA单分子测序技术。下面我们将对目前迅速发展的 DNA测序创新技术进行讨论。杂交测序的优点是检测速度快，采用标准化的高密 度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本。但是，由于序列相似的模板DNA和 探针DNA在形成双螺旋结构方面的稳定性差别很小，容易造成信号的假阳性。另 外杂交测序方法可能无法阅读人类基因组中大量各种重复序列。合成测序方法通 过在大量固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，控制四种碱基在 DNA引物上的延伸，通过检测延伸反应过程或延伸碱基，实现高通量并行的DNA 序列信息的检测。目前，推出商业化的合成测序仪器的公司有罗氏(Roche)公司旗 下的454 Life Sciences Corp和英国剑桥大学派生的Solexa公司。454公司的测序仪 器中使用了焦测序(pyrosequencing)技术，利用合成时释放的焦磷酸(PPi)分子的有 无和多少来进行对所测模板序列的判读。2007年5月底，454 Life Sciences和贝勒 医学院人类基因组测序中心合作，使用该公司的Genome Sequencer FLX测序仪， 只用了两个月的时间，就完成对DNA双螺旋的发现者之一沃森的个体全基因组序 列测定，其测序成本不到IOO万美元。Solexa公司采用了与454 Life Sciences不同的 合成测序原理。Solexa公司采用四种结构新颖的可逆终止核香酸单体(reversible terminator)和拥有一系列天然酶分子所不具备性质的新型酶分子，以及标准的微 阵列光学检测系统来同时检测阵列中那些被固定DNA链上的引物延伸过程。 Solexa的测序技术借助于产生极高密度的单分子阵列，将全基因组分析的大规模 并行处理(massively parallel processing)和" 一 管，，样品制备(one-tube sample preparation)相结合，在降低基因组测序的成本和提高测序的效率方面取得了重要 性的突破。Solexa用这种方法对人类DNA中长度为162 kb的片段进行了测序，并 与人类基因组计划得到的标准参考序列进行比较，其测序结果的准确率超过 99.99%，并且发现了已知在这个片段中存在的全部162个常见的SNP突变位点。另 外，应用生物系统公司(ABI)发展的SOLiD(Supported Oligo Ligation Detection)测序 技术发展也很迅速，SOLiD的测序策略与454公司和Solexa公司都有戶> 不同，SOLiD测序技术使用了 DNA连接酶进行测序，因此有时也被称作为连接测序 (sequenceing by ligation), 2007年6月，ABI向市场推出了使用该方法的SOLiD测序 系统，该系统每运行一次产生大约l Gb的碱基序列信息。目前该系统已经成功的 用于对C. e/egara和E co"的再测序。在对￡.0>//的再测序结果中，该方法发现了一 个用Sanger测序法拼接时遗漏的大重复序列。尽管合成测序方法已经取得了重要 的进展，但合成测序方法的阅读长度相对较短并且测序DNA模板阵列的制备农赖 于PCR扩增，这不仅在测序模板的扩增拷贝过程中容易引入复制错误，而且PCR 扩增存在明显的偏向性，这对于有效地获得全基因组测序模板阵列形成了重要的 技术瓶颈。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供一种利用硫代寡核普酸探针的DNA测序方 法，该方法进一步降低DNA的测序成本，提高每一个序列的测序长度，并缩短 每个碱基的阅读时间。通过一种含疏代核苷的测序引物，采用杂交-酶连接-酶切 割的高通量测序技术，为DNA序列分析提供一种新方法，建立快速、.准确、和 低成本的高通量DNA序列测定技术。技术方案本专利技术利用硫代寡核苷酸探针的DNA测序方法的测序步骤为硫代寡核苷酸探针的构建硫代寡核苷酸探针序列的5，-3，端依次为锚定区、 识别区和剪切区，锚定区含有n个核脊酸或碱基类似物，其中0<nSlO;识别区含 有m个核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用硫代寡核苷酸探针的ＤＮＡ测序方法，其特征在于测序步骤为：Ａ．硫代寡核苷酸探针的构建：硫代寡核苷酸探针序列的５’－３’端依次为锚定区、识别区和剪切区，锚定区含有ｎ个核苷酸或碱基类似物，其中０＜ｎ≤１０；识别区含有ｍ个核苷酸或碱基类似物，其中０＜ｍ≤１０，并且识别区３’端第一个核苷酸或碱基类似物与５’方向邻接着的核苷酸或碱基类似物之间为硫代修饰的磷酸键；剪切区含有ｋ个核苷酸或碱基类似物，其中０＜ｋ≤１０；剪切区序列上设有与识别区对应的标记物；Ｂ．测序循环：ａ）．利用测序定位引物与待测单链ＤＮＡ模板进行杂交，清洗去除多余的测序定位引物；ｂ）．将硫代寡核苷酸探针与步骤ａ所得待测单链ＤＮＡ模板进行杂交，在连接酶的作用下，与待测单链ＤＮＡ模板完全匹配的硫代寡核苷酸探针和紧邻着测序定位引物完成连接反应，然后清除未连接以及游离的硫代寡核苷酸探针；ｃ）．读取标记物的信号种类和强度，确定此次与识别区互补的待测单链ＤＮＡ模板的信息；ｄ）．利用受阻于硫代修饰磷酸键的外切酶去除步骤ｃ所得测序定位引物相连的硫代寡核苷酸探针上的剪切区；ｅ）．重复上述步骤ｂ－ｄ２～１０次，完成该轮测序。ｆ）．对步骤ｅ所得产物进行变性，得到初始的待测单链ＤＮＡ模板，用３’端比上一轮少一个核苷酸的测序定位引物重复ａ－ｅ步骤；ｇ）．重复ｆ步骤ｎ－１次。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陆祖宏，罗俊峰，肖鹏峰，孙蓓丽，贾超，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]